超嗜热菌亮氨酰-tRNA合成酶的高表达和一步纯化氨基酰-tRNA合成酶复合物结构和功能的研究

摘要

超嗜热菌(Aquifex aeolicus)亮氨酰-tRNA合成酶，αβ-LeuRS，是已知唯一的杂合二体亮氨酰-tRNA合成酶。它包含α和β两个亚基，分子量分别是74.0KDa和33.5 KDa。编码α基的基因被克隆进入pSBET-b载体，并在其序列前添加编码6个组氨酸的寡核苷酸片段。pSBET-b载体含有编码稀有的大肠杆菌(Escherichia coli) tRNA<'Arg>(AGA／AGG)的argU基因，该基因有助于含有高频率AGA／AGG密码予的αβ-LeuRS在E.coli中火量表达。编码β亚基的基因被克隆进入pET-15b载体。两个重组质粒被共转化进入E.coli BL21-CodonPlus(DE3)茼株，进而表达基因产生αβ-LeuRS。该酶的α亚基N-端带有6个组氨酸，利用Ni-NTA亲和层析纯化，从250毫升培养基中得到7毫克纯化的αβ-LeuRS。N-端的组氨酸对酶的氨基酰化活力没有影响。 人胞质亮氨酰-tRNA合成酶(hcLeuRS)足一个多合成酶复合物(aaRS复合物)的组成成分，这与以游离形式存在的原核和低等真核生物的亮氨酰-tRNA合成酶(LeuRS)有显著不同。在本实验室已经纯化了hcLeuRS的基础，本文作者进一步研究了它的性质。由于hcLeuRS和原核及低等真核生物的LeuRS相比具有突出的C-末端延伸肽段，利用昆虫表达系统，纯化了缺失C-末端延伸肽段的突变酶(ΔChcLeuRS)，测定了ΔChcLeuRS和hcLeuRS对ATP，亮氨酸和tRNA的动力学常数，热稳定性，以及在293T细胞中的定位，证明了这两种酶的上述性质都没有显著差异。进一步的体内和体外实验证明，hcLeuRS的C-末端延伸肽段是该酶和aaRS复合物中另一成分一人胞质精氨酰-tRNA合成酶(hcArgRS)相互作用的位点，两个酶的相互作用仅通过hcLeuRS的C-末端延伸肽段和hcArgRS的N-末端延伸肽段进行。 高等真核生物的氨基酰-tRNA合成酶复合物(aaRS复合物)的功能目前还知之甚少。p43，p38和p18是aaRS复合物的重要结构蛋白质，纯化了这三种蛋白质，研究了它们对hcLeuRS和△ChcLeuRS，hcArgRS和N-末端延伸肽段缺失的人胞质精氨酰-tRNA合成酶(△NhcArgRS)，以及不同种属来源的LeuRS的活力影响，第一次证明了这三种辅助因子对aaRS的活力具有促进作用，这种促进作用与延伸的末端肽段没有必然关系，三种因子对LeuRS的促进作用还具有种属专一性。结合以前的实验结果，对aaRS复合物形成的原因和行使的功能进行了探讨。

目录

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摘要

第一部分超嗜热菌Aquifex aeolicus亮氨酰-tRNA合成酶的高表达和纯化

摘要

1引言

2材料和方法

3结果和讨论

4参考文献

第二部分氨基酰-Trna合成酶复合物结构和功能的研究：第一章复合物中亮氨酰-tRNA合成酶的C-末端延伸肽段与精氨酰-tRNA合成酶相互作用

摘要

1引言

2材料和方法

3实验结果

4讨论

5参考文献

第二部分氨基酰-Trna合成酶复合物结构和功能的研究：第二章氨基酰-tRNA合成酶复合物中辅助因子对氨基酰-tRNA合成酶具有活力促进作用

摘要

1引言

2材料和方法

3实验结果

4讨论

5参考文献

结论

附录：本论文缩写汇编

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