蛋白糖基化分析新方法研究

摘要

糖基化是真核细胞蛋白质最常见的转译后修饰方式之一，连接在天冬酰胺上的称为N-糖链，连接在丝氨酸或者苏氨酸上的称为O-糖链。蛋白糖基化在许多生命活动中起重要作用，包括蛋白质折叠、细胞识别、癌细胞增殖、免疫反应等。蛋白N糖基化分析有很多方法。最简单的方法是酶解释放N糖链后直接进行MS质谱分析。Peptide-N-glycosidase F(PNGase F)是一种用来从蛋白或多肽上酶解没有取代的或6位岩藻糖取代的N糖链的酶，现广泛应用于哺乳动物的N糖基化研究中。一些进一步的研究就建立在这些释放下来的N糖链上。更常见的情况下，是将N糖链释放后进行衍生化以改善其分离度和增强检测灵敏度。
　　本研究建立了一种新的 N糖基化的分析方法，其中优化了去糖基化的反应条件和试剂，以加快 N糖链的释放速度，并采用了一种能够同时提高分离度和荧光、质谱响应灵敏度的新型标记试剂（Rap iF luor-MS）来标记释放下来的糖链。此外，为了简化数据分析难度，我们还建立了一个虚拟的N糖链数据库，使得复杂的N糖链数据能够被自动、精确有效地识别和归属。最终形成一套简单、快速、灵敏、高效的N糖基化分析方法，并将其成功应用到了复杂糖蛋白和癌细胞表面N糖基化分析中。另外，由于目前没有广谱O-糖基解离酶，我们初步建立了一种有效的O-糖链分析方法。该方法采用了高能碰撞解离产物离子相关电子转移解离（HCD-pd-ETD）二级质谱模式对广谱蛋白酶降解得到的糖肽进行分析，并对数据采用较新的 Byo nic软件进行了分析，这种方法可以同时得到 O-糖基化位点和糖链形式两种信息。该方法有效的应用到了复杂糖蛋白人重组骨唾液酸化蛋白（rhiBSP）的 O-糖链分析和解析过程中，获得了比传统方法更准确和丰富的糖基化位点和糖链结构信息。

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第一章 引 言

1. 1糖蛋白简介

1.1.1 糖蛋白的结构

1.1.2 糖蛋白的生物合成与降解

1.1.3 糖蛋白生物活性及糖蛋白药物

1. 2蛋白糖基化分析的质谱分析研究进展

1. 3细胞中的糖组学研究

1. 4本论文研究的主要内容

第二章 N-糖基化分析方法的建立

2. 1 前言

2. 2 实验部分

2.2.1 仪器与试剂

2.2.2 实验原理

2.2.3 实验步骤

2.2.4 实验结果与讨论

2. 3 本章总结

第三章 N-糖基化分析方法在复杂样品中的应用

3. 1 前言

3. 2 实验部分

3.2.1仪器与试剂

3.2.2 实验原理

3.2.3 实验步骤

3.2.4 实验结果与讨论

3. 3 本章总结

第四章 糖肽分析

4. 1 前言

4. 2 实验部分

4.2.1仪器与试剂

4.2.2 实验原理

4.2.3 实验步骤

4.2.3 实验结果与讨论

4. 3 本章总结

论文总结与展望

参考文献

攻读学位期间本人出版或公开发表的论著、论文

缩写词表

致谢