SMN2基因内含子6的A-44G置换改善脊髓性肌萎缩症的临床表型

摘要

背景和目的：脊髓性肌萎缩症（Spinal muscular atrophy,SMA）是一种常见的神经肌肉疾病，由于脊髓α运动神经元缺失导致广泛性的骨骼肌萎缩，尤其是四肢和躯干。SMA是由运动神经元存活蛋白（survivor of motor neuron,SMN）表达减少引起的。SMA患者中，编码SMN蛋白的SMN1基因由于基因功能失活不能产生正常的SMN蛋白，其同源的SMN2基因也因为外显子7第6个碱基变化（C6T）仅表达有限的全长SMN蛋白。根据SMA病人临床的严重程度和发病的年龄，SMA分为四种类型，I型是最严重的类型，II型为中间型，III型为温和型，IV型为成人型。SMN2基因的拷贝数是调控SMA严重程度的一个关键因素。一般情况下，大多数严重的I型SMA病人携带1-2个SMN2拷贝；大多数中度的II型SMA病人携带3个SMN2拷贝；而大多数温和的III型SMA病人携带3-4个SMN2拷贝。然而，有很多病人SMN2的拷贝数并不与临床严重程度呈负相关。比如，携带3个拷贝SMN2基因的患者可以是I型和III型，还有极少数为I和IV型。
　　Thomas Prior等研究发现3例患者外显子7上的c.859G>C突变促进SMN2外显子7列入（exon inclusion），从而解释了为何这些患者仅携带2个SMN2拷贝却疾病轻微。近期，Thomas Prior医生又发现一组53位携带3个拷贝SMN2的患者，被诊断为SMA时皆已20余岁，显示III或IV型的临床特征，通过基因组测序发现有5位患者的一个SMN2拷贝是从SMN1基因转变（gene convertion）而成，但转变仅发生于C6T，而其他部位仍和SMN1基因一致，这一等位基因（allele）相当于SMN1C6T。这种从SMN1到SMN2的基因转换没有在较严重的患者中发现，因此我们推测SMN1C6T的外显子7剪接可能得到了改善，导致SMN蛋白表达增加，从而缓解患者的病情。
　　方法：基因测序分析SMA患者基因型；构建SMN1/2 minigene载体用于可变剪接验证；通过定点突变技术分析影响SMN1/2外显子7列入的关键置换；通过最小自由能与外显子7列入的相关性分析二级结构对SMN1/2剪接变化的影响；通过删除突变分析SMN1/2内含子6上影响剪接的顺式作用元件；通过RNA色谱分析与质谱鉴定揭示结合顺式作用元件的RNA结合蛋白；通过MS2靶向实验验证RNA结合蛋白对剪接的调控作用；通过对RNA结合蛋白结构域的分析解释其影响剪接的机制；过表达与敲低RNA结合蛋白验证其对SMN1/2基因可变剪接的调控作用。
　　结果：SMN1 C6T的pre-mRNA外显子7剪接比SMN2更有效；SMN1/2上的G-44A突变会抑制全长mRNA、SMN蛋白的产生；G-44A位点附近是一个内含子剪接沉默子；HuR能结合到顺式作用元件上，G-44A突变会增加HuR的结合，从而抑制全长mRNA的产生；HuR的RRM1和RRM2结构域介导剪接抑制作用；过表达HuR抑制外显子7列入，敲低HuR促进外显子7列入；
　　结论：我们发现了一种新的提高SMN蛋白水平、缓解SMA患者病情的新机制。A-44G的碱基变化显著降低了HuR对SMN1/2内含子6上剪接沉默子的亲和力，从而造成了外显子7列入的适度增加。

目录

声明

一、前言

二、材料与方法

1．实验材料

2．实验方法

三、结果

1． 53名患者中5例（0 SMN1/3 SMN2）的SMN1基因不完全转变

2．SMN1 C6T的pre-mRNA剪接效率比SMN2更有效

3．G-44A的转变减少了外显子7的列入

4．RNA二级结构与G-44A抑制效应无关

5．G-44A位点附近是剪接沉默子

6．剪接沉默子的RNA结合蛋白的鉴定

7．HuR对SMN2外显子7剪接调控的抑制作用

8．HuR的RRM1\2结构域介导剪接抑制作用

9．AU-cluster促进HuR与pre-mRNA的结合

10．G-44A转变增强HuR与pre-mRNA的结合

小结

四、讨论

参考文献

综述:反义寡核苷酸的可变剪接调控

1.RNA剪接与可变剪接

2.顺式作用元件对可变剪接调控机制

3. ASO作用分子机制

4.ASO发展及修饰

5.ASO药物开发

6.ASO筛选

7.ASO未来研究方向

参考文献

附录：缩略词表

攻读学位期间发表的论文

致谢