米诺环素通过抑制NLRP3炎症小体激活保护缺血性脑损伤的作用研究

摘要

脑卒中是目前仅次于癌症和心血管疾病的导致人类死亡的第三大原因，也是导致慢性、重度成人残疾的主要原因，其具有发病率高、复发率高、死亡率高和致残率高的特点，严重危害人类的生命与健康。根据其临床发病特点不同，可以将脑卒中分为缺血性脑卒中和出血性脑卒中两大类，全球范围内，缺血性脑卒中患者约占所有卒中患者的70％，据统计，我国缺血性脑卒中约占所有卒中病例的85%，死亡率高达50%，存活的缺血性脑卒中患者中约有3/4不同程度地丧失劳动能力或遗留有瘫痪，失语等严重的后遗症。
　　缺血性脑卒中涉及众多分子机制，其中包括兴奋性毒性、氧化/硝化应激、炎症、凋亡、梗死周围区去极化等。近年来人们致力于研究脑缺血急性期的神经损伤性级联反应，并在动物模型上已发现很多具有神经保护作用的化合物，但转化后的临床效果均不太理想。因此，阐明缺血性脑卒中的确切病理机制，提出新的卒中后神经保护策略仍然是当前亟待解决的问题。
　　越来越多的研究表明一种被称为炎症小体（inflammasomes）的多蛋白复合物组装激活后可以明显加重缺血性脑损伤程度。NLRP3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor（NLR）Pyrin domain containing3）炎症小体就是其中一种，其在中枢神经系统和外周免疫细胞中大量表达。最近的研究结果表明，NLRP3炎症小体参与缺血性脑卒中的病理进程，NLRP3炎症小体介导的无菌性炎症反应在缺血性脑卒中后的细胞损伤及组织损伤中发挥着重要的作用，抑制NLRP3炎症小体可对缺血性脑卒中后脑组织发挥保护作用。因此，发现与研发靶向NLRP3炎症小体介导的炎症反应的药物可能给缺血性脑卒中的治疗提供很好的思路。
　　米诺环素（Minocycline，MC）是于1967年首次制得的第二代半合成四环素类抗生素，其具有抗菌能力强大、抗菌谱广，不易产生耐药性，容易通过血脑屏障等特点。研究表明，米诺环素在阿尔茨海默病、脑外伤、脊髓损伤、多发性硬化、肌萎缩侧索硬化癫痫和帕金森病等多种动物疾病模型中具有神经保护的作用。虽然，最初认为米诺环素在中枢神经系统疾病中发挥抗炎作用，但是目前米诺环素被发现拥有多种其他作用机制，包括抗凋亡和神经保护作用等。在中枢神经系统，米诺环素的抗炎作用是通过抑制小胶质细胞的活化介导的，并且可以减少谷氨酸毒性，抑制一氧化氮合酶和p38丝裂原活化蛋白激酶的表达。但米诺环素是否可以作用于小胶质细胞的 NLRP3炎症小体，从而调控缺血性脑卒中后炎症因子释放调节炎性反应未有文章报道。
　　鉴于上述，本文第一部分工作研究了米诺环素对暂时性大脑中动脉闭塞（transient middle cerebral artery occlusion，tMCAO）脑缺血再灌注模型小鼠急性期损伤的保护作用，发现其对急性梗死缺血半暗带区的小胶质细胞存在抑制作用，并对炎症因子的释放起到调节作用，并研究了小胶质细胞中NLRP3炎症小体的表达分布情况。本课题第二部分研究了在离体氧糖剥夺（Oxygen Glucose Deprivation，OGD）模型条件下小胶质细胞株 BV2释放炎症因子以及炎症小体激活通路相关蛋白的表达情况。研究结果提示，米诺环素可以通过抑制小胶质细胞NLRP3炎症小体的激活而对缺血性脑卒中发挥保护作用。
　　第一部分小鼠暂时性大脑中动脉缺血再灌注模型的建立及米诺环素对缺血性脑损伤的保护作用研究
　　目的：建立小鼠大脑中动脉闭塞缺血再灌注模型，并初步探讨米诺环素对缺血再灌注小鼠模型的保护作用。
　　方法：应用10-12周龄雄性C57BL/6J小鼠117只，随机分为伪手术组、模型对照组、生理盐水组和不同剂量的米诺环素治疗组。采用线栓法建立暂时性大脑中动脉闭塞（tMCAO）缺血再灌注模型，缺血1 h后血流再灌注，复灌1 h后根据分组分别腹腔注射生理盐水、10，25及50mg/kg米诺环素药物溶液，一日注射一次。再灌注72小时后通过2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride，TTC）染色并计算小鼠脑梗死体积、神经运动缺陷评分和脑水肿程度的变化，并利用Elisa方法检测缺血半暗带区炎性因子IL-1β和IL-18的蛋白水平，免疫组织化学方法研究缺血半暗带区小胶质细胞的激活状态以及利用免疫荧光化学方法测定小胶质细胞中NLRP3蛋白的表达情况。
　　结果:
　　1.米诺环素减小tMCAO/R后小鼠脑梗死体积
　　2.米诺环素改善tMCAO/R后小鼠神经功能障碍
　　3.米诺环素减轻tMCAO/R后小鼠脑水肿程度
　　4.米诺环素降低tMCAO/R后小鼠缺血半暗带IL-1β和IL-18蛋白水平
　　5.米诺环素抑制tMCAO/R后小鼠缺血半暗带小胶质细胞过度激活
　　6.米诺环素降低tMCAO/R后小鼠缺血半暗带小胶质细胞NLRP3蛋白水平
　　结论：
　　1.米诺环素对缺血再灌注模型小鼠脑组织发挥保护作用
　　2.米诺环素可降低缺血性脑卒中后脑组织的炎症水平
　　3.米诺环素可降低缺血性脑卒中后NLRP3炎症小体活化程度
　　第二部分米诺环素抑制氧糖剥夺后小胶质细胞NLRP3炎症小体激活的机制研究
　　目的：研究米诺环素对氧糖剥夺（OGD）后小胶质细胞NLRP3炎症小体激活状态的影响。
　　方法：建立BV2小胶质细胞株OGD/R模型，用Elisa法检测缺糖缺氧1 h，复糖复氧24 h后的小胶质细胞培养液中的炎性因子IL-1β、IL-18、TNF-α和IL-6的蛋白水平，并利用Western Bloting法检测细胞胞浆内NLRP3炎症小体激活相关蛋白NLRP3，procaspase-1，proIL-1β，p65，以及细胞胞核中p65的蛋白水平和细胞培养液中 caspase-1和IL-1β蛋白水平。
　　结果：
　　1.米诺环素减少OGD/R后BV2细胞上清中IL-1β和IL-18蛋白水平
　　2.米诺环素减少OGD/R后BV2细胞上清中TNF-α和IL-6蛋白水平
　　3.米诺环素抑制OGD/R后BV2细胞NLRP3炎症小体激活
　　结论：
　　1.米诺环素降低氧糖剥夺模型BV2小胶质细胞炎性水平
　　2.米诺环素通过抑制OGD/R后BV2细胞NLRP3炎症小体激活通路降低模型后炎症水平

目录

前言

第一部分 小鼠暂时性大脑中动脉缺血再灌注模型的建立及米诺环素对缺血性脑损伤的保护作用研究

第一节 建立小鼠暂时性大脑中动脉闭塞缺血再灌注模型

材料和方法

结果

讨论

第二节 米诺环素对小鼠暂时性大脑中动脉闭塞缺血再灌注模型抗炎作用的实验研究

材料与方法

结果

讨论

第二部分 米诺环素抑制氧糖剥夺模型小胶质细胞NLRP3炎症小体激活的实验研究

材料与方法

1 材料

2 方法

3.数据处理及分析

结果

1.米诺环素减少OGD/R模型后BV2细胞IL-1β和IL-18的蛋白释放

2.米诺环素减少OGD/R模型后BV2细胞释放TNF-α，IL-6蛋白水平

3.米诺环素抑制OGD/R模型后BV2细胞NLRP3炎症小体激活

讨论

参考文献

综述: 炎症小体在中枢神经系统中的作用

英文缩略词表

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