空泡型质子泵V-ATPases在胃癌增殖侵袭中的作用及山荷叶素干预机制研究

摘要

研究背景：
　　 胃癌是常见消化道恶性肿瘤之一，我国胃癌患者死亡率较高。胃癌的侵袭转移是治疗失败及复发的重要原因，临床尚缺乏有效的干预措施。
　　 近来研究发现，肿瘤的侵袭转移与空泡型质子泵(thevacuolarH+-adenosinetriphosphatase，V-ATPases)密切相关。在肿瘤组织中V-ATPases高表达，并能够感知细胞内pH，以ATP为能量，将癌细胞产生的过多的H+泵出细胞外，导致胞外的酸性微环境。国内上海交通大学肿瘤研究所通过RNA干扰技术抑制V-ATPases的基因表达，有效抑制了肿瘤的侵袭转移。但V-ATPases在利用质子泵功能维持细胞内外特定的pH值同时，又作用于哪些信号通路影响肿瘤细胞的侵袭转移能力，尚未明确。本研究拟通过沉默胃癌细胞SGC7901中V-ATPases表达，研究V-ATPases与Wnt/B-catenin信号通路之间的关系。
　　 近年来，已经发现一些药物及分子能抑制V-ATPases，如巴弗洛霉素、NIK12192及FR202126等，但尚无相关药物进入临床。山荷叶素是传统中药山荷叶提取物的主要成分，属于木脂素类化合物，具有较好的抗肿瘤活性，而对正常细胞毒性很小。但山荷叶素抗肿瘤的确切机制尚未完全清楚。近来有研究表明，山荷叶素能抑制破骨细胞的V-ATPases的活性，且抑制活性与山荷叶素有剂量依赖关系。那么山荷叶素对胃癌细胞V-ATPases是否同样具有抑制作用，且效应如何？国内外尚无相关报道。基于上述研究前提，本项目选择了山荷叶素作为胃癌细胞V-ATPases抑制剂，研究其阻断Wnt/B-catenin信号通路的作用及与胃癌细胞增殖侵袭的关系。
　　 本实验分为三个部分:第一部分研究V-ATPases蛋白表达和胃癌临床病理特征和预后的相关性;第二部分研究沉默V-ATPases基因对胃癌细胞SGC7901增殖和侵袭能力的影响及机制;第三部分为山荷叶素调控V-ATPases对胃癌细胞增殖侵袭影响的体内外研究。
　　 第一部分、V-ATPases蛋白表达和胃癌临床病理特征及预后的相关性研究
　　 目的:研究V-ATPases蛋白在胃癌组织中的表达及与临床病理特征和预后的相关性。
　　 方法:运用免疫组化技术检测50例胃癌组织、正常组织的V-ATPases蛋白表达水平，并统计分析V-ATPases表达与临床病理指标和预后的关系。
　　 结果:胃癌组织中V-ATPases蛋白阳性表达率为76％，高于正常组织(30%)。胃癌组织中V-ATPases表达与肿瘤大小(P=0.017)、病理分级(P=0.038)、淋巴结转移(P=0.029)有相关性，与其它临床病理特征性别、年龄、浸润深度、脉管浸润及TNM分期无明显相关性；在运用Cox回归单因素模型进行单变量分析中，肿瘤大小、脉管浸润、淋巴结转移、浸润深度、TNM分期和V-ATPases是重要的预后影响因素，p值分别为0.000、0.009、0.003、0.000、0.000、0.000。采用Cox比例多因素模型进行多变量分析结果显示，V-ATPases表达和TNM分期可能是预后的独立影响因素，p值分别为0.010和0.001。
　　 结论:V-ATPases在胃癌组织中的蛋白表达水平明显高于正常组织，V-ATPases可能与胃癌发生、进展相关。V-ATPases蛋白表达与肿瘤大小、病理分级、淋巴结转移有关，可能是影响胃癌预后的一个重要指标。
　　 第二部分、沉默V-ATPases基因对胃癌细胞SGC7901增殖和侵袭能力的影响及机制
　　 目的:利用转染小干扰RNA沉默人胃癌细胞株SGC7901的V-ATPases，分析V-ATPases在对胃癌细胞增殖、转移的作用及机制。
　　 方法:对于未转染的细胞株、转染siRNA-GAPDH、转染siRNA-V-ATPases的SGC7901细胞株，采用MTT试剂盒测定其细胞的生存率，以及克隆形成试验计算增殖率;运用AnnexinV/PI双染法检测细胞凋亡;采用Transwell进行细胞侵袭试验，以确定V-ATPases在胃癌细胞侵袭中的作用；并测定干扰前后SGC7901细胞株中Wnt/β-catenin信号通路中LRP磷酸化及对其下游基因的表达。
　　 结果:SGC7901细胞株经转染siRNA-V-ATPases后，细胞的增殖、克隆形成能力显著降低，凋亡率显著上升，并表现出剂量依赖关系。Transwell实验结果提示，转染siRNA-V-ATPase后SGC7901细胞迁移能力下降。以上结果提示，V-ATPases在胃癌的增殖、侵袭中具有一定作用。进一步研究结果显示，干扰SGC7901细胞株V-ATPases表达后，LRP磷酸化受到抑制，Wnt/β-catenin信号通路中下游基因β-catenin、Cyclin-D1及C-Myc表达显著下降(P＜0.05)。
　　 结论:V-ATPases在胃癌细胞株SGC7901增殖、侵袭中具有一定作用，靶向抑制V-ATPases后，胃癌细胞株SGC7901增殖、侵袭能力下降，同时能抑制Wnt/β-catenin信号通路中LRP磷酸化。V-ATPases有望成为治疗胃癌新的靶点。
　　 第三部分、山荷叶素调控V-ATPases对胃癌细胞增殖侵袭影响的体内外研究
　　 目的:研究山荷叶素(diphyllin)对胃癌细胞SGC7901增殖和侵袭的影响，并探讨与V-ATPases表达、Wnt/β-catenin信号通路的关系。
　　 方法:将不同浓度的diphyllin作用于SGC7901细胞株不同时间，采用MTT试剂盒测定其细胞的生存率，以及克隆形成试验计算增殖率。采用Transwell进行细胞侵袭试验，以确定山荷叶素在胃癌细胞侵袭中的作用;并测定山荷叶素作用前后SGC7901细胞株中Wnt/β-catenin信号通路中LRP磷酸化及其下游基因表达的差异。建立裸鼠皮下荷瘤模型，分析diphyllin在裸鼠体内对胃癌生长的影响。
　　 结果:不同浓度的diphyllin作用于SGC7901细胞后，细胞的增殖、克隆形成能力显著降低，凋亡率显著上升，并表现出剂量依赖关系,48小时IC50为7.8μM。5μM、10μM浓度山荷叶素作用后SGC7901细胞迁移能力下降。同时，diphyllin能抑制胃癌细胞中V-APTase基因及蛋白表达，并降低细胞内pH，逆转细胞内外pH梯度。进一步研究发现，山荷叶素能抑制磷酸化LRP表达，并下调其下游基因B-catenin、Cyclin-D1及C-Myc表达（P＜0.05）。动物实验结果显示，裸鼠在给予diphyllin后，移植瘤体积显著减小，净体重较对照组升高，瘤体中V-APTases表达下降，外周血清中MMP-2、MMP-9表达显著下降(P＜0.05)。
　　 结论:diphyllin在体内外均可抑制胃癌细胞SGC7901的增殖、侵袭能力，并诱导凋亡，其机制可能与抑制V-APTases表达、抑制Wnt/β-catenin信号通路有关。

目录

声明

摘要

前言

正文

第一部分 V-ATPases蛋白表达和胃癌临床病理特征及预后的相关性研究

参考文献

第二部分 沉默V-ATPases基因对胃癌细胞SGC7901增殖和侵袭能力的影响及机制

参考文献

第三部分 山荷叶素调控V-ATPases对胃癌细胞增殖侵袭影响的体内外研究

参考文献

附录一:缩略语与英汉对照

附录二 综述

附录三 攻读博士学位期间所发表的论文

致谢

作者简介