藤梨根提取物对大肠癌细胞增殖和凋亡的影响及其机制的研究

摘要

研究目的:
　　 藤梨根是临床常用的治疗大肠肿瘤的中草药，其抗肿瘤作用已经为药理学及分子学研究证实，但针对目前对大肠癌抗癌抑癌的作用机理、治疗靶点等缺乏研究。为了明确藤梨根提取物对大肠癌细胞凋亡过程中凋亡相关基因Bcl-2、Bax、Caspase-3的影响及增殖抑制作用的效应，据此了解藤梨根提取物对大肠癌细胞的抗癌抑瘤的部分作用机制与量效关系，开展本研究。
　　 研究方法:
　　 一、体外实验：采用醇提取工艺提取藤梨根抗癌有效活性成分(简称EERAC)，分别配制成10μg/ml、40μg/ml、160μg/ml、320μg/ml的制剂，将96孔LoVo培养板分成4个组，分别滴加上述不同浓度的EERAC。然后:(1)采用倒置显微镜观察不同浓度EERAC对培养孔内的LoVo细胞形态结构变化的影响，并采用AO/EB和Hoechst33258二种荧光染色观察细胞核内染色质改变、核固缩、细胞膜皱缩，凋亡小体等;(2)采用MTT法检测不同浓度EERAC对大肠癌LoVo细胞的抑制作用;(3)采用琼脂糖凝胶电泳法观察不同浓度EERAC在体外实验组中对LoVo细胞的DNAladder的形成情况;(4)采用流式细胞仪测定不同浓度EERAC对LoVo细胞周期的影响;(5)采用免疫化学法(IHC)测定不同浓度EERAC对LoVo细胞凋亡相关基因Bcl-2，Bax，Caspase-3的蛋白表达变化;
　　 二、体内实验:建立大肠癌细胞HT-29荷瘤裸鼠模型，观察:(1)不同剂量（5、10、20mg/kg）EERAC荷瘤裸鼠体重、种植瘤生长抑制作用、对血常规、肝功能和肾功能、免疫器官的影响;(2)并采用LDH释放法测定不同剂量EERAC对裸鼠NK细胞的活性;(3)采用IHC法测定不同剂量EERAC在HT-29荷瘤裸鼠体内凋亡相关基因Bcl-2，Bax，Caspase-3的蛋白表达。
　　 研究结果:
　　 一、体外实验
　　 (1)与空白组比较，在不同浓度的EERAC组，其LoVo细胞密度减低，增殖变慢;细胞逐渐变大、变圆，细胞间接触变松，胞浆中颗粒增多，空泡化，脱壁，细胞周围碎片增多，荧光染色观察可见细胞凋亡的特征学形态改变出现。
　　 (2)MTT法测定显示，EERAC对LoVo细胞的最佳作用时间为72h，最大抑制率为79.48％;
　　 (3)琼脂糖凝胶电泳法检测显示随着实验药物浓度的增高，DNA断裂明显增多，DNAladder在320μg/mL组表达最强。
　　 (4)滴加EERAC处理24h后，LoVo细胞的G0/G1期细胞比例增高，S期和G2/M期的细胞减少，凋亡率为6.8%、13.1%、18.2%和26.3%，与空白组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　 (5)EERAC作用LoVo细胞24后，Bcl-2表达明显减弱，Bax、Caspase-3表达水平明显增高，Bcl-2/Bax比值下降，其效应与浓度相关。
　　 二、体内实验:
　　 (1)不同剂量的EERAC对HT-29移植瘤均有明显的抑制作用，各剂量组的抑瘤率为9.12%，20.13%,37.81%，与药物浓度呈正比;不同剂量的EERAC对荷瘤裸鼠的WBC、脾脏指数等免疫指标均有所增加，对肝肾功能无明显影响。
　　 (2)不同剂量的EERAC均可使NK细胞活性度增加。
　　 (3)不同剂量的EERAC作用后，LoVo细胞的Bcl-2表达减弱，Bax、Caspase-3表达水平增高，Bcl-2/Bax比值下降，其作用也呈浓度相关性。
　　 研究结论:
　　 1、EERAC对大肠癌LoVo细胞具有明显抑制增殖作用，浓度越高、作用时间越长其抑制增殖作用越明显;EERAC能阻滞癌细胞的在有丝分裂周期的S期增殖，能阻断癌细胞DNA物质的合成，高浓度时阻断作用更明显;
　　 2、体内外实验研究均证实，EERAC对大肠癌细胞或种植瘤具有抑制增殖和诱导凋亡的作用，且其作用强度与浓度或剂量呈正相关。其作用机制在于降低Bcl-2的表达，增强Bax、Caspase-3表达水平，下调Bcl-2/Bax比值。
　　 3、EERAC对机体的体重、血常规、肝肾功能无明显影响，同时对机体的免疫功能有一定的增加作用。EERAC其抑痛作用虽差于5-Fu，但其对作用的HT-29荷瘤裸鼠的WBC、脾脏指数等体内免疫指标有提高作用;表明EERAC的抑瘤的同时，有助于提高机体免疫能力，且无5-Fu的明显毒副作用。
　　 4、在体内实验中，EERAC对大肠癌细胞的抑制作用与剂量有一定的相关性，高剂量组的疗效较好，且无明显毒副作用。按相关换算法则计算，临床治疗大肠癌时，可以适当提高藤梨根在单张处方中的用量以提高抗癌疗效，初步建议较理想的抗癌剂量为30-35g。

目录

声明

前言

第一部分 理论研究

第一章 祖国医学对大肠癌的认识及诊治现状

1 对病名的认识

2 对病因病机的认识

3 对大肠癌治疗的认识

4 对大肠癌的中医药诊治现状

第二章 治疗大肠癌的中草药研究现状

1 抑制肿瘤细胞增殖和诱导分化

2 促进肿瘤细胞凋亡

3 阻断细胞周期与凋亡诱导双重作用

4 抑制肿瘤新生血管形成

5 抑制肿瘤细胞粘附、侵袭和转移

6 逆转肿瘤细胞多药耐药性

7 提高机体免疫功能

8 现状分析

第三章 藤梨根的抗癌研究现状与进展

1 藤梨根抗肿瘤作用的药理学研究

2 藤梨根抗癌治疗的临床研究

第二部分 实验研究

实验一、藤梨根抗癌活性成分的提取

(一)实验材料和设备

(二)实验方法

(三)藤梨根有效活性成分提取物的质量控制

实验二、EERAC对人大肠癌LoVo细胞形态学的影响

(一)实验材料和设备

(二)实验方法

(三)结果

(四)结果分析

实验三 MTT法观察EERAC体外对大肠癌LoVo细胞的抑制作用

(一)实验材料和设备

(二)实验方法

(三)结果

(四)结果分析

实验四 EERAC对大肠癌loVo细胞周期的影响

(一)实验材料和设备

(二)实验方法

(三)实验结果

(四)结果分析

实验五 琼脂糖凝胶电泳法观察EERAC对各实验组LoVo细胞中DNA的影响

(一)实验材料和设备

(二)实验方法

(三)实验结果

(四)结果分析

实验六 免疫化学法(IHC)测定LoVo细胞中凋亡相关基因Bcl-2，Bax，Caspase-3的表达变化

(一)实验材料和设备

(二)实验方法

(四)实验结果

(四)结果分析

实验七 各浓度EERC对大肠癌HT-29细胞荷瘤裸鼠体重、种植瘤生长抑制作用

(一)实验材料和设备

(二)实验方法

(三)实验结果

(四)结果分析

实验八 测定EERAC对各实验组HT-29荷瘤裸鼠血常规和肝、肾功能的影响

(一)实验材料和设备

(二)实验方法

(三)实验结果

(四)结果分析

实验九 HT-29荷肿瘤裸鼠体内凋亡相关基因Bcl-2，Bax，Caspase-3的表达变化的IHC测定

(一)实验材料和设备

(二)实验方法

(三)实验结果

(四)结果分析

第三部分 讨论

1 肿瘤细胞的增殖与凋亡

2 EERAC对大肠癌肿瘤细胞增殖和凋亡的影响

3 EERAC的毒副作用和免疫功能的影响

4 EERAC与5-Fu的比较

5 藤梨根治疗大肠癌的临床用药建议剂量

6 结论

7 创新点

8 结语及展望

参考文献

致谢

作者简介