毛冠鹿性连锁基因的克隆与性染色体鉴定研究

摘要

毛冠鹿存在种内核型多态,目前已发现六种核型:1983年张锡然等报道了两种(2n=48,♂和2n=47,♀),并建立其细胞株.此后,王宗仁、施立明等报道另外两种核型(2n=46,♀,1984;2n=47,♂,1991).该实验室近年又发现两种新核型(2n=48,♀,1998;2n=48,♂,2002).仔细观察和分析发现这种多态主要表现在染色体形态、数目以及染色体长度的多态,变化主要集中在异染色质丰富的几条染色体上,而这几条染色体正是核型中不配对的异型染色体.根据人和鼠性别分化相关的ZFY、ZFX基因序列设计引物,以雌雄毛冠鹿的基因组DNA为模板进行PCR扩增,将扩增产物克隆到pMD18T上,获得ZFY、ZFX重组克隆,并测定了ZFY、ZFX基因片段的序列,序列比较显示两者同源性达91﹪,仅在少数位点有差异,以此确定AvaⅡ为ZFX上特异酶切位点,通过PCR扩增和AvaⅡ特异酶切对毛冠鹿性别进行鉴定.通过基因克隆、染色体显微切割、DOP-PCR以及荧光原位杂交(FISH)等技术,首先获得了一些与毛冠鹿性别和性染色体相关的基因,如ZFX/ZFY基因、SRY基因、G6PD基因、DYZ重复序列等,进而在显微切割的单条染色体上扩增这些基因,从而推断核型Ⅵ(2n=48,♂)中的一对异型染色体一条为X染色体,一条为Y染色体;核型V(2n=48,♀)中的一对大的端着丝粒染色体为X染色体.分别用人X、Y染色体特异的整条染色体涂染探针,通过荧光原位杂交的方法,检测核型Ⅰ中是否存在与人X、Y染色体同源的片段,结果显示该毛冠鹿间期、中期细胞都呈阴性,提示可能毛冠鹿与人的亲缘关系较远.

目录

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Abstract

第一章综述

1.毛冠鹿种内核型多态

2.麂亚科动物性别决定的研究现状

3.性染色体连锁的基因与性别鉴定

3.1 ZFX/ZFY

3.2SRY

3.3 G6PD

3.4雄性特异的重复序列

3.5AMEL(Amelogenin)

第二章毛冠鹿ZFX、ZFY基因片段的克隆与性别鉴定

前言

1.实验材料

2.主要仪器

3.主要试剂

4.实验方法

4.1毛冠鹿细胞原代培养及传代培养

4.2细胞冻存

4.3染色体制片和核型分析

4.4 DNA提取

4.5引物设计

4.6 PCR扩增

4.7扩增产物纯化

4.8克隆

4.9测序与序列分析

4.10酶切鉴定性别

5.实验结果

5.1 PCR产物检测

5.2 ZFY/ZFX测序分析

5.3氨基酸序列推导

5.4性别鉴定

5.5毛冠鹿核型检测结果

6.讨论

第三章性染色体连锁基因片段的克隆测序与分析

前言

1.实验材料

2.主要仪器

3.主要试剂

4.实验方法

4.1毛冠鹿SRY基因的克隆测序

4.2毛冠鹿DYZ重复序列的克隆测序

4.3毛冠鹿G6PD基因片段的克隆测序

4.4测序与序列分析

5.实验结果

5.1毛冠鹿SRY基因全序列分析

5.2毛冠鹿DYZ重复序列分析

5.3毛冠鹿G6PD基因片段序列分析

6.讨论

第四章毛冠鹿性染色体分子鉴定——利用染色体显微切割与FISH技术对毛冠鹿性染色体进行分子鉴定

前言

1.实验材料

2.主要仪器

3.主要试剂

4.实验方法

4.1染色体显微切割

4.2 DOP-PCR

4.3 PCR扩增ZFX/ZFY基因片段和SRY基因片段

4.4荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)

5.实验结果

5.1 PCR扩增ZFX/ZFY基因片段和SRY基因片段

5.2荧光原位杂交结果

6.讨论

参考文献

附录1：图版及说明

附录2：测序图谱

致谢