毛冠鹿大脑组织cDNA文库构建及神经递质转运蛋白基因的克隆与分析

摘要

运用SMART技术构建了毛冠鹿(Elaphodus cephalophus)大脑组织全长cDNA文库。提取大脑组织总RNA，Oligotex mRNA Klit纯化、获得poly(A)<'+>RNA，以CDS Ⅲ／3'PcR引物进行逆转录，LD-PCR扩增获得全长双链cDNA，经SfiⅠ酶切及柱层析分离后，500 bp以上的片段与载体λTripIEx2连接，体外包装得到cDNA文库。经鉴定原始文库滴度为5.1 x10<'5>pfu/ml，扩增后文库滴度为1.5×10<'9>pfu/ml，重组率达到85％以上，插入片断平均长度约为1.0 kb，说明构建文库质量符合要求，可用于大脑特异表达基因的筛选。从该文库中克隆到了rig(rat insulinoma gene)基因全长(522bp)，包含5’和3’非编码区，从第43至477个核苷酸为一完整阅读框(ORF)，此阅读框可编码一个145氨基酸的rig蛋白。 为获得性连锁基因，在毛冠鹿睾丸组织cDNA文库中进行EST序列测定，共测得82个序列，其中27个为3’端序列，55+N5’端序列，将获得的cDNA序列用序列分析软件BLAsT与GellBank数据库中己知基因进行同源性比较，得到4个新基因，8个基因有重复，将序列在牛或人染色体上定位，发现其中3个基因定位在X染色体上提取毛冠鹿高分子量基因组DNA，HindⅢ酶切毛冠鹿基因组DNA，将酶切后的基因组DNA转移至尼龙膜。从毛冠鹿睾丸组织cDNA文库中克隆到神经递质转运蛋白(Neurotrallsmitter transporter)基因，用PCR法地高辛(DIG)标记DNA探针，用标记的探针进行Soulthem杂交。结果显示，经HindⅢ酶切杂交后雌雄结果无差异，都产生了2条杂交带。以毛冠鹿脑、肌肉、心脏、肺、睾丸、肾、肝和脾的总RNA为模板，合成cDNA第一链，用毛冠鹿神经递质转运蛋白基因特异引物RT-PCR分析不同组织mRNA表达状况。以毛冠鹿β2-微球蛋白基因的RT-PCR扩增产物作为阳性对照。结果表明神经递质转运蛋白基因仅在睾丸组织中表达，而其他组织不表达。

目录

文摘

英文文摘

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第一章综述

第二章大脑组织全长cDNA文库构建及质量分析

第三章毛冠鹿睾丸组织cDNA文库的测序

第四章神经递质转运蛋白基因的Southern blot及RT-PCR分析

参考文献：

致谢