外源钙对沉水植物重金属胁迫的缓解效应及机理研究

摘要

本文以分布广泛的沉水植物-黑藻(Hydrilla verticillata)、伊乐藻(Elodeacanadensis)和菹草(Potamogeton crispus)为研究对象，以植物非必需金属元素镉(Cd)和兼具营养和毒害双重效应的金属元素铜(Cu)为胁迫因子，应用植物生理生化和差异蛋白质组学技术研究了适宜浓度的外源钙(Ca)对沉水植物重金属胁迫的缓解效应和机理。结果表明：
　　(1)对比研究了Cd胁迫及施加适宜浓度的外源Ca后，黑藻体内Cd含量及矿质营养、光合色素、可溶性蛋白、小分子保护物质以及渗透调节物质等指标的变化。结果表明：单一Cd胁迫使黑藻体内Cd含量极显著增加，并造成明显的矿质营养失衡，主要表现为显著降低了P、K、Fe、Cu、Mn的含量，而外源Ca则削弱了黑藻对Cd的蓄积，并在一定程度上减轻了Cd胁迫所造成的矿质元素失衡。Cd处理使黑藻体内光合色素含量、叶绿素a/b值和可溶性蛋白含量大幅度下降并显著降低了黑藻的总抗氧化能力(T-AOC)和小分子保护物质[谷胱甘肽(GSH)、抗坏血酸(AsA)]的含量，而外源Ca有效延缓了黑藻的失绿症状，促进了可溶性蛋白的合成并提高了黑藻的抗氧化能力。此外，Cd胁迫显著促进黑藻大量积累脯氨酸、非蛋白巯基(NP-SH)和植物络合素(PCs)，而施加外源Ca则能有效逆转这一变化。可溶性糖则与之相反。说明外源Ca能通过抑制Cd的蓄积，延缓光合色素、可溶性蛋白和可溶性糖的降解，维持高的总抗氧化能力和抗氧化物质含量以及矿质营养平衡等途径来增强黑藻对Cd胁迫的抗性。
　　(2)分析了外源Ca对Cd胁迫下伊乐藻体内活性氧产生、保护酶系统和蛋白质表达的影响。研究结果表明：与单一Cd胁迫相比，外源Ca显著提高了伊乐藻体内超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)和谷胱甘肽还原酶(GR)活性，增强了细胞的抗氧化能力，从而降低了超氧阴离子(O2-)产生速率和过氧化氢(H2O2)含量，有效地缓解了Cd胁迫造成的活性氧的积累。双向电泳图谱分析结果表明：Cd处理与对照相比，蛋白丰度变化在2倍以上且重复性好的差异表达蛋白点有61个，其中28个蛋白点被抑制或下调，33个蛋白点被诱导或上调；Cd+Ca处理与单一Cd毒害相比，有63个蛋白点的表达量发生可重复的显著变化，其中42个蛋白点被抑制或下调，21个蛋白点被诱导或上调。我们对这些差异蛋白点进行了质谱鉴定，其功能分为7类：光合作用、能量代谢、转运、防御、信号转导、转录和翻译以及功能未知蛋白。其中，与光合作用和能量代谢相关的蛋白所占比例较大。这些结果表明外源Ca通过提高保护酶活性、减少活性氧积累以及调控某些特异蛋白的表达等途径来缓解Cd胁迫对伊乐藻的毒害作用。
　　(3)研究了外源Ca对Cu胁迫下伊乐藻体内生理生化指标及蛋白质表达的影响。结果表明：0.01 mM Cu处理4 d后，Cu大量累积，伊乐藻呈现出多种重金属毒害症状，如矿质营养吸收紊乱，光合色素、可溶性蛋白、渗透调节物质、总抗氧化能力(T-AOC)和小分子保护物质(GSH、AsA、NP-SH)的含量都显著降低，O2-产生速率、H2O2和丙二醛(MDA)含量升高，细胞死亡加剧。与单一Cu毒害相比，外源Ca减少了Cu的累积并有效地缓解了Cu造成的伊乐藻矿质营养吸收的失衡，还提高了伊乐藻体内光合色素、可溶性蛋白、脯氨酸和可溶性糖以及T-AOC和AsA、GSH、NP-SH的水平；降低了O2-产生速率、H2O2、MDA含量和细胞死亡，缓解了Cu胁迫所诱导的氧化胁迫。双向电泳结果发现，Cu胁迫下有131个蛋白点的表达量发生显著差异，其中有34个蛋白点被诱导或上调，97个蛋白点被抑制或下调；与Cu毒害相比，有76个蛋白点的表达在外源Ca处理后发生显著变化，其中55个蛋白点被诱导或上调，21个蛋白点被抑制或下调。这些结果表明外源Ca通过减少Cu的蓄积、改善生理代谢、增强抗氧化系统、缓解氧化胁迫以及调节蛋白质的表达等途径来增强伊乐藻对Cu胁迫的耐受性。
　　(4)研究了在施加外源Ca的同时加入钙调素(CaM)拮抗剂W7对菹草抗Cd、Cu胁迫能力的影响。结果表明：外源Ca对Cd、Cu胁迫具有明显的缓解作用。外源Ca处理明显减少了Cd、Cu在菹草叶片内的累积，促进菹草对营养元素的吸收，有效地维持了矿质营养吸收的平衡。此外，外源Ca显著提高了菹草叶片中光合色素、可溶性蛋白、GSH的含量、T-AOC以及微粒体膜上的Ca2+-ATPase活性，降低了O2-产生速率、H2O2和MDA含量，有效地缓解了重金属诱导的氧化胁迫。而在施加Ca的同时加入W7处理却使菹草的抗氧化能力降低，显著提高了O2-产生速率、H2O2和MDA含量，加剧了Cd、Cu胁迫对光合色素和可溶性蛋白的破坏，抑制了Ca2+-ATPase活性，从而加重了Cd、Cu胁迫对菹草的损伤。这表明外源Ca对沉水植物重金属胁迫的缓解效应与诱导和调控Ca2+-CaM信使系统密切相关。

目录

文摘

英文文摘

第一章 前言与综述

1 重金属污染概述

2 重金属对植物的毒害作用及机制

3 植物对重金属的抗性机制

3.1 避性

3.2 耐性

4 钙与逆境胁迫

4.1 钙的生理功能

4.2 外源钙提高植物抗逆境胁迫能力的作用机理

4.3 钙对重金属胁迫的缓解作用

第二章 外源钙对黑藻抗镉胁迫能力的影响

1 材料与方法

1.1 材料处理

1.2 实验方法

2 结果与分析

2.1 外源Ca对Cd胁迫下黑藻Cd含量的影响

2.2 外源Ca对Cd胁迫下黑藻营养元素吸收的影响

2.3 外源Ca对Cd胁迫下黑藻光合色素含量和叶绿素a/b值的影响

2.4 外源Ca对Cd胁迫下黑藻可溶性蛋白含量的影响

2.5 外源Ca对Cd胁迫下黑藻脯氨酸和可溶性糖含量的影响

2.6 外源Ca对Cd胁迫下黑藻T-AOC的影响

2.7 外源Ca对Cd胁迫下黑藻GSH和AsA含量的影响

2.8 外源Ca对Cd胁迫下黑藻NP-SH和PCs含量的影响

3 讨论

第三章 外源钙对伊乐藻抗镉、铜胁迫能力的影响

第一节 外源钙对镉胁迫下伊乐藻抗氧化系统及蛋白质表达的影响

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 结论

第二节 外源钙对铜胁迫下伊乐藻生理生化特性的影响

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第四章 钙和钙调素拮抗剂W7对菹草抗镉、铜胁迫能力的影响

第一节 钙和钙调素拮抗剂W7对菹草抗镉胁迫能力的影响

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第二节 钙和钙调素拮抗剂W7对菹草抗铜胁迫能力的影响

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

论文小结

附录A 部分蛋白点质谱分析图谱

附录B 缩略表

参考文献

在读期间发表的论文

致谢