一种重组工程介导的大肠杆菌基因组点突变的方法

摘要

重组工程(Red/ET, recombination mediated genetic engineering)是指由重组酶催化的DNA片段之间的同源重组而在大肠杆菌中进行基因克隆或DNA改造的一种基因工程技术。通过重组工程方法理论上可以对细菌基因组任意大小的DNA片段进行敲除和修饰，重组工程的优点由于是利用PCR所获得的DNA片段进行转化，省略了基因克隆步骤，因而简便、快速而高效。
　　本论文提供了一种通过重组工程来实现大肠杆菌的基因点突变的方法。首先是通过重组工程将含有同源臂的两个I-SceI酶切位点(S)和卡那霉素抗性基因(neo)的基因盒整合至待修饰的基因，含同源臂的S-neo-S基因盒由PCR获得，此基因盒两侧还包含了与基因组同源的序列和待引入的突变位点。再经过cTc诱导，使I-SceI酶得到表达。诱导得到的I-SceI酶切割突变菌株上的S位点，从而使基因组发生断裂。断裂的基因组在生存压力和体内重组酶的作用下再次发生同源重组，从而去掉抗性基因，得到任何不含冗余序列的定点突变菌株。通过研究同源臂长度对基因敲除效率和标记基因去除效率的影响，发现基因敲除时同源臂长度50bp和抗性去除实验同源臂长度为30bp时，重组效率达到最高。在上述最优条件下，大肠杆菌基因组定点突变的效率达到80％。
　　此实验方法用来实现LacZ基因，nanA基因的敲除、LacZ基因、nanA基因的点突变。第一步的重组效率平均可达到80％;而去除抗性的步骤中重组效率可达90％以上。

目录

声明

名词简写

摘要

第一章 文献综述

1．重组

1．1 基因重组

1．2 同源重组及不同生物中的基因重组

2．重组工程的研究进展

2．1 重组工程及其原理

2．2 重组工程的研究简史及发展概况

2．3 重组工程介导的基因敲除研究进展

2．4 无冗余碱基基因敲除研究概况

2．5 重组工程的应用

第二章 同源臂长度对大肠杆菌基因敲除效率的影响

前言

第一节 同源臂长度40bp时大肠杆菌MG1655 LacZ基因的敲除

1．实验材料

2．实验方法

3．实验结果

4．讨论

第二节 同源臂长度36bp，30bp，25bp，20bp时大肠杆菌MG1655 LacZ基因的敲除

1．实验材料

2．实验方法

3．实验结果

4．讨论

第三节 同源臂长度50bp时大肠杆菌W3110 nanA基因的敲除

1．实验材料

2．实验方法

3．实验结果

4．讨论

第四节 同源臂长度30bp时大肠杆菌W3110 nanA基因的敲除

1．实验材料

2．实验方法

3．实验结果

4．讨论

第三章 重组工程介导的大肠杆菌基因组定点突变

前言

第一节 大肠杆菌MG1655 LaeZ基因的点突变

1．实验材料

2．实验方法

3．实验结果

第二节 大肠杆菌MG1655 nanA基因的点突变

1．实验材料

2．实验方法

3．实验结果

第四章 恶臭假单胞菌KT2440的重组工程法基因敲除

前言

1．实验材料

2．实验方法

3．实验结果

4．讨论

该技术的优缺点及创新之处

参考文献

附录

致谢