枯草芽孢杆菌发酵豆粕生产大豆活性多肽的研究

摘要

大豆多肽是大豆蛋白经酸、碱或酶的水解作用后得到的由不同氨基酸组成的多肽链的通称，目前一般是指平均肽链长度为3～10个氨基酸残基，主要分子量范围为300～3000Da的低分子量短链肽。由于它们不仅具有良好的加工特性，还具有多种对人体有益的生理功能，因此它们也常被叫做大豆活性肽或大豆功能多肽等，并被视为一种很有前途的功能性食品而备受科研人员的关注。 目前我国对大豆多肽的生产研究虽然很多，但尚未形成大规模工业化生产。其原因有两个：一在于生产成本居高不下；二蛋白酶解液往往产生苦味，严重影响了多肽制品的口味。 为克服目前我国在大豆活性肽研究和产业化中的不足，本课题建立一套生物技术生产大豆活性肽的工艺。主要是通过微生物发酵法产酶水解豆粕中的大豆蛋白，以获得具有生理活性的大豆多肽；并通过数理优化，确立了合适的发酵工艺：同时研究了膜技术在活性肽分离纯化上的应用；对发酵菌株的产酶特性及脱苦原理进行了探讨；研究了发酵所得大豆多肽的生物活性和加工特性，并在此基础上开发出一种具有抗疲劳效果的大豆多肽功能性饮料。主要研究结果如下： 1、在参照常规酶水解蛋白工艺中蛋白水解度的测定方法基础上建立了一种适于微生物发酵水解蛋白工艺的水解度测定方法。本方法通过测定肽键的断裂数来反映蛋白被水解的程度，从原理上符合肽键被水解的规律，计算公式上反映了水解度的定义。操作简单，快速，重复性好。 2、研究了菌株Bacillus．subtilis SHZ在发酵豆粕过程中代谢产酶水解大豆蛋白的动态。结果表明该菌株能产蛋白酶和羧肽酶，在发酵的0～8 h，菌体主要分泌蛋白酶，将豆粕中的大豆蛋白初步水解成长链肽，发酵液略有苦味；随着发酵的继续进行(8～16h)，蛋白酶将长链肽进一步水解成段中短链肽，同时在外肽酶的作用下，肽链内部的疏水性氨基酸大量暴露，使得发酵液苦味激增；发酵中后期(24～32h)，菌体开始大量分泌羧肽酶，其能从肽链的羧基末端将疏水性的氨基酸切除从而脱苦；至发酵后期(40～48h)，发酵液中主要为非苦味的短链肽和游离氨基酸。控制发酵时间为36h，可以得到36h水解度为25％，分子量分布为300～1000Da的短肽链。 3、通过对比用碱性蛋白酶水解大豆蛋白所得到酶解物和用B.subtili SHZ发酵豆粕制备所得大豆多肽之间的苦味值和氨基酸组成，发现具有显著苦味的蛋白酶解液的氨基酸37.69％为疏水性氨基酸；而豆粕水解液中，疏水性氨基酸仅占总量的11.75％。利用B.subtili SHZ来发酵具有显著苦味的蛋白酶解液，发酵到20h，蛋白酶解液的苦味值由4降到0，苦味完全脱除，．证实了发酵菌株具有脱苦作用并推断其中存在具有脱苦作用的肽酶产生体系。对B. subtili $HZ产肽酶特性进行进一步研究，发现其能在生长代谢过程中产生胞外的羧胰静。对此羧肽酶进行初步分离纯化，经硫酸铵沉淀、乙醇分级沉淀和凝胶层析后，羧肽酶比活力由4.5提高到24.5，但酶蛋白和总酶活损失较大，回收率只有12.7％。将纯化后得到的且subtili SHZ羧肽酶直接作用于苦味的蛋白酶解物上进行酶解：其能从苦昧肽的羧基末端将苯丙氨酸、亮氨酸、酪氨酸、异亮氨酸等疏水性氨基酸切除，以游离态释放出来，从而生成不苦的酶解物，这就是B．subtili SHZ脱苦的机理。 4、为获得最高大豆多肽产量，采用响应曲面法对B．subtiIi SHZ发酵豆粕产大豆多肽的培养基组成和发酵条件进行了优化。首先采用Box-Behnken实验设计对培养基进行了优化，最终获得大豆多肽产量最高的发酵培养基组成为，豆粕(氮源)52～58g/L，葡萄糖(碳源)7～9g/1，KH<,2>PO<,4>(无机盐)3g/l。以此发酵培养基可以获得约为8m咖L的大豆多肽，比优化前的平均6mg/mL提高了33％。接着在优化培养基的基础上，采用CCD实验设计对发酵条件进行了优化，最终获得大豆多肽产量最高的发酵条件为，发酵时间36h，温度37℃，发酵液初始pH 7，摇床转速140～160rpm。以此发酵条件可以获得约为14mg/mL的大豆多肽，’比上述的8mg/mL又提高了65％。按照此最优工艺发酵生产大豆多肽，豆粕中的大豆蛋白转化为大豆多肽的转化率高达60％，是常规酶解法的3倍。 5、研究了超滤对发酵液的纯化效果，结果表明在发酵液中，仅有0.85％的肽分子质量大于30KDa；有2.42％的肽分子质量在30～10KDa之间：而5～3KDa之间和小于5KDa的多肽分别占了总肽量20.4％和63.4％。同时生物活性测定表明，高分子量(>10KDa)的多肽液自由基清除能力较低，而·自由基和-OH自由基清除率分别高达49％和82％，比同浓度的天然抗氧化剂生育酚的自由基清除力还强。对超滤各参数的研究表明，选用料液浓度50mg/mL，料液温度30℃，操作压力0.08MPa能获得最佳膜通量和分离效果。随着截留分子量的不断降低，超滤液中肽的分子量在不断下降，纯度在逐步提高。经RP-HPLC验证，凝胶层析后所得具有最高生物活性的片段为单一多肽组分。 6、对发酵法制备的大豆多肽生物活性研究表明，其具有显著的自由基清除能力和体外抗氧化活性，活性随着纯化步骤的进行而不断提高，其中O<,2><'->清除能力从最初的49％提高到62％，.OH清除能力从78％提高到90％，相对抗氧化值从2.0提高到2.8，具有最强体外抗氧化能力的是分子量约为1，300Da的短链肽。其抗氧化能力是相同浓度生育酚的1.5倍。体内抗氧化实验表明，小鼠经灌胃大豆肽后，其血液中GSH-PX活力和SOD活力都得到了提高，MDA含量均低于标准饲料对照组，存在显著性差异(P<0.01)，表明大豆肽的体内抗氧化机理与其能提高生物体内的抗氧化酶活性有关。而灌胃中高剂量的大豆肽，降低MDA的效果比天然抗氧化剂生育酚(VE)的效果还明显(P<0.01)。对大豆多肽的体内抗疲劳实验表明，三个剂量组小鼠游泳时间均比对照组延长，大豆多肽中高剂量组能显著提高小鼠的肝糖原含量(p<0.05)，三个剂量组的小鼠在剧烈游泳后其血乳酸升高比值显著低于对照组，说明小鼠运动时疲劳增加延缓；而血乳酸清除比值均显著高于对照组(p<0.01)，说明其运动后疲劳消除加快。根据卫生部公布的保健食品评价指标，可判断发酵法制备所得大豆多肽具有抗疲劳的功能。 7、对发酵法制备的大豆多肽加工特性研究表明，其具有良好的溶解性，能在广泛的pH范围内保持较高的氮溶指数(NSI>80％)。与大豆分离蛋白相比，具有良好的凝胶性，同时亲水性大为增加。与大豆蛋白相比，大豆多肽具有良好的乳化性能，并在广泛的pH范围内(pH2～8)均表现出最好的乳化性和乳化稳定性。同时具有更多短链肽的发酵大豆多肽其起泡性和泡沫稳定性都要优于酶解法所得大豆多肽。 8、以发酵法制备的大豆多肽为原料，开发研制了大豆多肽功能性饮料。其最佳配方是以大豆多肽液(酸溶性多肽含量16mg/mL)为母液；各种添加剂添加量(W/V)分别为β-环糊精0.4％、柠檬酸0.2％、蔗糖9％、橙汁香精0.4％。最佳灭菌工艺采用微波灭菌法(80℃，10min)。最佳贮藏条件为冷藏(4℃)，在不添加任何稳定剂的情况下冷藏可放置2个月。功能性试验表明，以不同剂量的多肽饮料喂饮小鼠，实验小鼠游泳时间显著延长，其中高剂量组效果最为显著，与对照组相比，小鼠游泳时间延长了近一倍。表明该大豆多肽饮料具有一定的抗疲劳作用，

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩写符号、表格索引、图形索引

第一篇文献综述

第一章大豆多肽国内外研究进展

1.1大豆多肽简介

1.2大豆多肽的生产制备

1.3蛋白水解物的苦味与脱苦

1.4大豆多肽在食品工业中的应用及存在的问题

1.5本研究的目的意义及内容

参考文献

第二篇实验部分

第二章Bacillus subtilis SHZ发酵豆粕产大豆多肽的研究

2.1材料与方法

2.2结果与讨论

2.3本章小结

参考文献

第三章Bacillus subtilis SHZ产酶及脱苦作用的研究

3.1材料与方法

3.2结果与讨论

3.3本章小结

参考文献

第四章了Bacillus subtilis SHZ生产大豆多肽的发酵优代研究

4.1材料与方法

4.2结果与讨论

4.3本章小结

参考文献

第五章大豆多肽的分离纯化研究

5.1材料与方法

5.2结果与讨论

5.3本章小结

参考文献

第六章大豆多肽生物活性研究

6.1材料与方法

6.2结果与讨论

6.3本章小结

参考文献

第七章大豆多肽加工特性研究

7.1材料方法

7.2结果讨论

7.3本章小结

参考文献

第八章大豆多肽功能性饮料的研制

8.1材料方法

8.2结果与讨论

8.3本章小结

参考文献

全文结论

创新摘要

致谢

攻读博士期间投稿及发表论文