脱氢表雄酮对肉鸡肝脏脂肪代谢的影响及其细胞分子生物学机理研究

摘要

脱氢表雄酮（Dehydroepiandrosterone，DHEA）是类固醇激素合成过程的中间产物，在循环血液中主要以硫酸酯形式（Dehydroepiandrosterone sulfate，DHEA-S）存在.DHEA经靶器官中相关酶系的作用，可转化为多种类固醇激素。近年来因其广泛参与机体内一系列重要的生理反应而日益受到重视.DHEA对脂代谢方面的影响已较为肯定，但对肉鸡脂代谢方面的研究很少，其具体作用机理还不是十分清楚.本文选用生长速度快、腹部脂肪沉积多的Arbor Acres肉鸡（简称AA肉鸡）为实验动物，研究外源性DHEA对肉鸡肝脏脂肪代谢的影响；通过建立鸡胚原代肝细胞培养体系，探讨DHEA对鸡胚原代肝细胞脂代谢关键因子基因表达、cAMP/PKA信号通路及相关转录因子的影响，为深入探讨DHEA调控肉鸡脂肪沉积作用提供实验和理论依据.
　　 1 DHEA对AA肉鸡生产性能及相关代谢激素水平的影响
　　 180羽1日龄AA肉鸡（38g左右）随机分为对照组，饲料中添加20mg/kg和5mg/kgDHEA的高、低剂量组，每组3个重复，每个重复20只.饲喂至42日龄分别从各组随机选取12只公鸡和12只母鸡，采集血样、肝脏、腹脂.试剂盒测定肝脏中甘油三酯(TG)、非酯化脂肪酸(NEFA)含量以及肝脂酶(HL)活性；RIA法测定血清三碘甲腺原氨酸(T3)、甲状腺素(T4)、游离三碘甲腺原氨酸(FT3)、游离甲状腺素(FT4)、胰高血糖素(Glucagon)、瘦素(Leptin)含量.结果显示，与对照组相比，DHEA显著降低公、母肉鸡体重和腹脂率，提高相对肝重；显著降低肝脏中TG含量，提高HL活性和NEFA水平；DHEA可显著降低公鸡血清中T4、FT3、FT4的含量，显著升高Glucagon和Leptin水平；同样，DHEA可显著降低母鸡血清中FT3和FT4含量，显著升高Leptin水平.结果提示，DHEA可能通过影响肉鸡体内脂类分解相关酶的活性及激素水平，对脂类代谢起调节作用，且这种作用存在性别差异。
　　 2 DHEA对AA肉鸡肝脏脂肪代谢关键因子基因表达和肝组织超微结构的影响与调节研究
　　 180羽1日龄AA肉鸡(38g)随机分为对照组，饲料中添加20mg/kg和5mg/kgDHEA的高、低剂量组，每组3个重复，每个重复20只.饲喂至42日龄时分别从各组随机选取12只公鸡和12只母鸡，采集肝脏.RT-PCR半定量检测肉鸡肝脏脂肪代谢关键因子固醇调节元件结合蛋白-1（SREBP-1）、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)、肉碱棕榈酰转移酶Ⅰ(CPTⅠ)和脂酰辅酶A氧化酶1(ACOX1)基因mRNA水平；透射电镜观察肝组织超微结构.结果显示，与对照组相比，DHEA对公、母鸡肝脏SREBP-1和ACC表达水无明显影响；DHEA显著上调PPARα、CPTⅠ和ACOX1 mRNA水平；DHEA处理后可显著增加公、母鸡肝细胞中过氧化物酶体数目.结果提示，DHEA降脂的主要机理是通过提高脂肪分解代谢关键因子表达以及过氧化物酶体数量，加快脂肪酸β-氧化进程，以减少脂肪在肝脏的合成。
　　 3 DHEA对鸡胚原代肝细胞脂肪代谢关键因子基因表达和细胞超微结构的影响与调节研究
　　 选用体外条件下培养的鸡胚原代肝细胞为实验对象，用含DHEA终浓度为0μmol/L、1μmol/L、10μmol/L和100μmol/L的培养液孵育细胞。分别作用1h、2h、4h、6h、12h、24h、48h、72h及6d后吸出培养液，收集细胞，待测.RT-PCR半定量检测肝细胞脂肪代谢关键因子SREBP-1、ACC、PPARα和CPTⅠmRNA水平：透射电镜观察DHEA处理6d的肝细胞超微结构；MTT法测定DHEA处理肝细胞24h、48h、72h后的细胞存活率.结果显示，10μmol/L和100μmol/LDHEA处理肝细胞1h和2h能极显著降低SREBP-1和ACC的mRNA水平，随后开始上升，在4-48h内与对照组相比没有显著性差异.10μmol/LDHEA在作用肝细胞1h和2h能极显著降低PPARα的mRNA水平，100μmol/LDHEA处理组则在2h显著降低，随后开始升高，在6-48h以上两个处理组显著提高PPARα的mRNA水平。10μmol/L和100μmol/LDHEA处理肝细胞1-4h对CPTⅠ的mRNA水平无显著性影响，随着作用时间的延长，6-48h内CPTI的mRNA水平极显著升高.1μmol/LDHEA处理组在各个时间点对上述基因mRNA水平均无显著性影响；透射电镜结果显示，与对照组相比，10μmol/L和100μmol/LDHEA使肝细胞中线粒体数目和基质电子密度明显提高；细胞存活率试验表明，1μmol/LDHEA处理肝细胞72h显著提高细胞存活率，与之相反，100μmol/LDHEA在各个时间点均显著降低细胞存活率，10μmol/LDHEA处理组与对照组相比无显著性差异.结果提示，10μmol/LDHEA在不影响肝细胞存活率的前提下，通过调控脂肪合成、分解代谢关键因子基因表达以及改变细胞超微结构，增强脂肪酸β-氧化，加快脂肪酸动员，降低肝细胞脂肪的合成。
　　 4 DHEA对鸡胚原代肝细胞cAMP/PKA信号通路和相关转录因子的影响与调节研究
　　 选用体外条件下培养的鸡胚原代肝细胞为实验对象，用含DHEA终浓度为0mol/L、0.01μmol/L、0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L和100μmol/L的培养液孵育细胞，在作用20min后吸出培养液，收集细胞.RIA法检测胞内3’，5，-环腺苷酸（cAMP）含量.结果显示，与对照组相比，0.1-100μmol/LDHEA组cAMP含量均显著提高，其中0.1μmol/LDHEA组cAMP含量最高.因此，以0.1μmol/LDHEA为试验组，分别在作用5min、10min、20min、30min和60min后收集细胞，分别检测胞内cAMP含量以及腺苷酸环化酶(AC)、磷酸二酯酶(PDE)和蛋白激酶A(PKA)活性；Westernblot法测定转录因子SREBP-1蛋白水平和cAMP反应元件结合蛋白(CREB)磷酸化水平.结果显示，O.1μmol/LDHEA作用肝细胞5-30min能显著提高胞内cAMP含量，且在20min达到最高，随着作用时间的延长，到60min时与对照组相比并无显著性差异。此外，试验组PDE活性在10min和20min均显著降低，而PKA活性在10min和20min显著提高，AC活性在各个时间点均无显著性差异；对相关转录因子的研究发现，DHEA处理可显著降低鸡胚原代肝细胞内SREBP-1蛋白水平，而CREB磷酸化水平则显著提高，且以上效应均被PKA的抑制剂阻断，结果提示，体外添加一定剂量DHEA处理肝细胞能够激活cAMP/PKA信号系统，经由PKA介导，显著下调相关转录因子蛋白表达水平和磷酸化水平，进而增强这一胞内效应以调控肉鸡肝脏的脂肪代谢，达到降低脂肪沉积的目的.

目录

文摘

英文文摘

本文部分缩写的中英文对照

引言

第一篇 文献综述

第一章 禽类脂肪代谢概述及其调控的研究进展

1 脂肪组织的基本特征及脂肪代谢特点

2 禽类脂肪代谢的关键因子研究进展

3 禽类脂肪代谢调控研究

第二章 脱氢表雄酮(DHEA)生物学功能研究进展

1 DHEA的合成、代谢与分布

2 DHEA的生物学功能

3 DHEA调节机体生理功能的机理研究进展

第三章 cAMP信号途径和基因表达调控

1 细胞内的信使物质

2 cAMP/PKA信号通路

第二篇 试验研究

第四章 DHEA对AA肉鸡生产性能及相关代谢激素水平的影响

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论与小结

第五章 DHEA对AA肉鸡肝脏脂肪代谢关键因子基因表达和肝组织超微结构的影响与调节研究

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论与小结

第六章 DHEA对鸡胚原代肝细胞脂肪代谢关键因子基因表达和细胞超微结构的影响与调节研究

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论与小结

第七章 DHEA对鸡胚原代肝细胞cAMP/PKA信号通路的影响

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论与小结

第八章 DHEA对鸡胚原代肝细胞脂肪代谢相关转录因子的调节研究

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论与小结

总体讨论

参考文献

全文结论

本论文创新点

博士间论文发表

致谢