新疆Boza的PCR-DGGE分析及其发酵工艺的研究

摘要

Boza，主要产地为中亚，中东和非洲地区部分国家，我国新疆地区的人民也有制作和饮用Boza的习惯。Boza是一种传统发酵饮品，主要原料是玉米，小米，小麦等谷物。发酵过程为自然发酵，利用酵母和乳酸菌的天然混合发酵剂，在一定的温度条件下发酵30小时左右，获得酒精浓度较低，有CO2杀口感，低糖度，质地浓稠的天然发酵饮料。在发酵过程中，酵母和乳酸菌提高了产品的营养价值，改善了食品的感官，并且促进了人体的消化吸收，使得Boza成为一种天然益生产品。由于Boza是天然发酵饮品，其发酵过程中的微生物构成复杂，对于Boza的微生物生态研究相对困难。国外有文献报道对产自土耳其等国家的Boza中的微生物进行传统方法的分离与鉴定，并利用分离鉴定的菌种，进行组合发酵实验，用可控的过程还原该传统饮品。对于产自我国新疆地区的Boza，尚未见到任何文献报道研究进展。本文选取产自我国新疆地区的Boza，利用分子生物学和传统分离鉴定方法对其微生物生态进行了研究，对得到的菌株进行纯培养，并应用于实验室制备Boza的组合发酵实验，旨在利用现代技术还原出这种传统食品的风味和质地。具体研究内容和结果如下：
　　 1利用PCR-DGGE技术，分析Boza中微生物构成
　　 利用PCR-DGGE技术构建Boza微生物指纹图谱。结果表明在酵母指纹图谱上显示出一条清晰的条带，在细菌的指纹图谱中出现四条清晰的条带，理论上说，在Boza样品中存在1种酵母和4种细菌。对这些条带包含的DNA进行回收，纯化，扩增，测序，通过GenBank比对，分别得到这5株微生物分别和酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae），植物乳杆菌（Lactobacterium plantarum），短乳杆菌（Lactobacillus brevis），巴氏醋酸杆菌（Acetobacer pasteurianus）和蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）相似度最高。
　　 2利用传统技术，分离出Boza中的微生物菌株并进行分子鉴定
　　 从Boza中分离出酵母一株，细菌4株。经分子鉴定得到这五株微生物分别与酿酒酵母，植物乳杆菌，短乳杆菌，醋酸杆菌和蜡状芽孢杆菌芽孢菌相似度最高。用含有GC夹的引物分别对酵母纯菌株的DNA的26S rDNA的D1可变区和细菌纯菌株的16S rDNA的V6-V8可变区进行扩增，然后与Boza中总酵母和细菌26S rDNA的D1可变区和细菌纯菌株的16S rDNA的V6-V8可变区的混合扩增产物分别进行酵母和细菌的变性梯度凝胶电泳，结果发现纯菌扩增片段的条带分别和混菌扩增的片段有一一对应关系。
　　 3酵母和细菌的发酵特性测试
　　 对分离出的酵母和细菌进行发酵特性测试。结果发现，蜡状芽孢杆菌具有产淀粉酶的活性，两株乳酸菌有产乳酸和乙酸的能力，啤酒酵母有产乙醇和CO2的能力，巴氏醋酸杆菌有产乙酸的能力。通过预发酵实验得到Boza发酵过程中微生物的生长规律。乳酸菌最先进入对数生长期，啤酒酵母其次，巴氏醋酸杆菌最后进入对数生长期，由此规律设计发酵优化实验。
　　 4调整菌株比例进行组合发酵实验，优化发酵工艺
　　 采用商业化淀粉酶来分解Boza发酵液中的淀粉，取代蜡状芽孢杆菌，增加淀粉分解效率。最终得到合适的发酵方法，即为：荞麦粉，玉米粉和高粱粉，按照质量比1:1:1的比例，混合成谷粉。称取一定量的谷粉，按10％（m/V）的比例加入沸水，边加热边搅拌，使谷粉充分糊化。在沸腾状态下，按照2％（m/V）的比例加入液化酶（α-淀粉酶，4000u/g），于90℃下保温液化1小时。待发酵液冷却到60℃，按照4％（m/V）的比例加入糖化酶（100000u/g），于60℃保温糖化5小时。115℃高温高压灭菌15min。按照3％植物乳杆菌+2％短乳杆菌+2％啤酒酵母+2％巴氏醋酸杆菌的接种比例接种，发酵温度为30℃，发酵时间为40小时。终产品的pH为3.49，滴定酸度为52，还原糖含量为39.5g/L，乙醇浓度为5650mg/L。

目录

文摘

英文文摘

图形索引

表格索引

第一章 文献综述

1 Boza的历史和特点

1.1 Boza的历史

1.2 Boza的传统制作方法

1.3 Boza的产品特征及保健作用

2 PCR-DGGE技术在微生物分子生态学研究中的应用

2.1 变性梯度凝胶电泳(DGGE)的原理

2.2 PCR-DGGE技术流程

2.3 PCR-DGGE技术在微生物分子生态学中的应用

316S rDNA和ITS序列分析在微生物分类鉴定中的应用

3.116S rDNA序列分析在原核生物分类鉴定中的应用

3.2 ITS序列分析在真核生物分类鉴定中的应用

参考文献

第二章 Boza中微生物群落结构的PCR-DGGE分析

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果与分析

2.1 细菌16S rDNA的V6-V8可变区和酵母26S rDNA的D1区的PCR结果

2.2 Boza中微生物群落结构的PCR-DGGE分析

3 讨论

参考文献

第三章 Boza发酵产品中优势菌株的分离鉴定及发酵特性的研究

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果与分析

2.1 Boza中乳酸菌和酵母菌的分离筛选

2.2 Boza中细菌和酵母菌的PCR-DGGE鉴定

2.3 Boza中细菌和酵母菌的分子鉴定

2.4 蜡状芽孢杆菌产淀粉酶活性实验

2.5 预发酵试验

3 讨论

3.1 PCR-DGGE结合传统分离方法鉴定Boza中的优势菌株

3.2 Boza中分离出的优势菌株的发酵特性

参考文献

第四章 Boza的发酵工艺研究

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果与分析

2.1 Boza乳酸菌组合发酵试验

2.2 啤酒酵母接种浓度对Boza发酵乙醇含量的影响

2.3 巴氏醋酸杆菌接种浓度对Boza发酵有机酸含量的影响

2.4 结论

3 讨论

参考文献

全文结论

致 谢