猪链球菌对大环内酯类药物的耐药机制及MefA-MsrD基因的全序列分析

摘要

目的：对临床分离的48株猪链球菌进行耐药性筛选；检测临床分离48株猪链球菌中大环内酯类及四环素类抗生素耐药基因的分布；分析临床分离的耐药猪链球菌与体外诱导耐药菌株的耐药机制的差异；对临床分离的4株含有mefA基因的猪链球菌中的mefA基因进行定位，并对其上下游未知序列进行分析。方法：采用微量稀释法测定10种药物对临床分离的48株猪链球菌的体外最小抑菌浓度(MIC)及改良双纸片法测定了48株菌对大环内酯类抗生素的耐药表型；建立PCR检测方法对分离菌株中大环内酯类耐药基因ermA/B/C、 mefA、 msrD、 mphB、23S rRNA、L4、L22和四环素类耐药基因tetM、 tetO、 tetL、 tetK及与Tn916转座子相关的int和xis基因进行检测；采用stepwise方法对敏感菌进行红霉素、泰乐菌素、阿奇霉素体外诱导耐药；建立PCR检测方法检测体外诱导耐药菌株耐药基因ermB、 ermA、 ermC、 mefA、 msrD、 mphB的分布及扩增23S rRNA及核糖体蛋白LA及L22;测定利血平存在的条件下，大环内酯类药物对临床分离和体外诱导耐药菌株MIC的影响；采用DNA Walking（染色体步移技术）的方法获mefA基因的相邻未知序列并将所获得的序列进行拼接并在NCBI上进行分析。结果：猪链球菌对红霉素、泰乐菌素、替米考星及阿奇霉素的耐药率分别达33.33％(16/48)、27.08％(13/48)、27.08％(13/48)和33.33％(16/48);对青霉素、氨苄西林、阿莫西林、头孢曲松钠、头孢喹肟均敏感，对四环素均耐药；16株红霉素耐药菌株中，以内在型耐药表型为主，占75％(12/16)，菌株MIC均为≥128mg·L-1;M型占25％(4/16)，大部分菌株MIC范围为1mg·L-1;未检测到诱导型耐药表型；耐药基因主要以ermB为主，占75％(12/16),mefA和msrD占25％(4/16),16株耐药菌株中，tetM,tetO、int、xis的检出率分别为31.25％(5/16)、62.5％(10/16)、31.25％(5/16)和31.25％(5/16)，没有检测到ermA/C、mphB、tetL、tetK。所有耐药菌株也均未检测到核糖体23SrRNA、核糖体蛋白L4和L22突变；体外诱导的耐药菌株均未检测到大环内酯类药物耐药基因，耐药机制的生主要是23SrRNA的位点A2061G、C2614A、A2062C及A2065C发生突变；核糖体蛋白L4的67-68之间插入S、Q及69-72位点插入W、P、Q、K和Q67R、K68T、R73G的突变；核糖体蛋白L22的84-86位点上发生3个氨基酸的缺失及K87Q突变引起的；在利血平存在的条件下，红霉素和阿奇霉素对具有mefA-msrD基因耐药菌的MIC会发生变化；泰乐菌素及替米考星对泰乐菌素诱导的具有L22氨基酸缺失的两株耐药菌株的MIC有明显变化；经DNA Walking测序，共得到5305bp的基因片段，进一步分析显示mefA基因位于染色体DNA上，大小为1218bp，下游为msrD基因，大小为1464bp。在5305bp的片段中，共包括7个开放阅读框。

目录

文摘

英文文摘

缩略词表

引言

第一章 文献综述

1 国内外猪链球菌对大环内酯类药物耐药状况

2 猪链球菌对大环内酯类药物耐药机制的研究

2.1 甲基转移酶Erm家族催化的甲基化引起的耐药

2.2 主动外排系统介导的耐药

2.3 核蛋白变异

3 四环素耐药基因tetM、tetO与ermB、mefA关系的研究

4 大环内酯类药物研究进展

参考文献

第二章 临床分离猪链球菌对大环内酯类抗生素的耐药性和耐药表型

1 材料与方法

1.1 菌株

1.2 培养基

1.3 药物

1.4 试验方法

2 结果

2.1 临床分离猪链球菌对大环内酯类等10种药物的敏感性

2.2 猪链球菌对MLS类抗生素耐药表型

3 讨论

参考文献

MACROLIDE RESISTANCE TRENDS AND PHENOTYPES OF 48 CLINLCAL ISOLATES OF STREPTOCOCCUS SUIS FROM CHINA

第三章 临床分离猪链球菌中大环内酯类和四环素类耐药基因的分布

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果

2.1 大环内酯类、四环素类相关耐药基因的检测

2.2 猪链球菌对大环内酯类抗生素的基因表型和耐药表型的相关性

2.3 耐药基因序列比对及同源性分析

3 讨论

3.1 大环内酯类抗生素耐药基因检测

3.2 四环素耐药基因的检测

3.3 四环素耐药和大环内酯类抗生素耐药的关系

参考文献

DETECTION OF MACROLIDE AND TETRACYCLINE RESISTANCE GENES STREPTOCOCCUS SIS

第四章 临床分离与体外诱导猪链球菌对大环内酯类药物耐药机制的差异

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果

2.1 体外人工诱导猪链球菌耐药菌株及对7种抗生素的敏感性

2.2 临床分离及体外诱导耐药菌株红霉素耐药基因的检测

2.3 临床分离与大环内酯类药物体外诱导猪链球菌耐药菌株突变基因的扩增

2.4 利血平对临床分离和体外诱导耐药菌株MIC的影响

3 讨论

参考文献

DIFFERENT MECHANISMS ACCOUNTING FOR MACROLIDE RESISTANCE IN STREPTOCOCCUS SUIS RESISTANT STRAINS SELECTED IN VITRO BY MACROLIDE PASSAGE AND ISOLATED FROM CLINIC

第五章 介导猪链球菌耐药的mefA基因在猪链球菌中的定位

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.2 方法

2 结果

2.1 mefA基因测序

2.2 mefA基因上游序列的获得

2.3 mefA-msrD基因序列的获得

2.4 msrD基因下游序列的获得

参考文献

TO LOCATE THE MEFA GENE OF STREPTOCOCCUS SUIS RESISTANT STRAINS

全文结论

致谢

攻读硕士期间论文发表情况