猪链球菌对大环内酯类药物耐药机制研究

摘要

随着养猪业的迅猛发展，猪链球菌病也在世界范围内广泛传播。猪链球菌病是由猪链球菌引起的一种重要人畜共患病，尤其是血清2型猪链球菌，不仅对猪的致病性最强，而且可感染特定人群并致死，给人类公共卫生和养猪业带来巨大影响。猪链球菌病表现为许多临床症状，如脑膜炎、关节炎、心内膜炎以及败血症。另外，健康猪只在鼻腔、扁桃体、上呼吸道和支气管也可以携带猪链球菌，加速了这种疾病的扩散和传播。 大环内酯类药物是由链霉菌产生的一类化学结构和抗菌作用相近的抗生素，他们都有一个大内酯环，这个内酯环通常为12～20元环。14元环包括红霉素、克拉霉素、罗红霉素；15元环为阿齐霉素；16元环有麦迪霉素、螺旋霉素、交沙霉素。兽医临床最常用的是红霉素和泰乐菌素。由于大环内酯类药物的临床应用和在饲料中添加预防亚治疗剂量该类药物，其耐药性也随之广泛产生，猪链球菌对大环内酯类的耐药率达50％以上。由于猪链球菌耐药性的产生往往导致治疗失败，且耐药基因可以在不同种属细菌间传播，引起多重耐药，后果严重。 猪链球菌对大环内酯类药物产生耐药的机制主要有三种，一种是结合靶位的甲基化，可以阻止药物与靶位的结合，其主要是由erm基因编码所产生的；第二种是细菌细胞膜的泵机制，将药物主动外排，使菌体内药物浓度降低，而产生耐药，其主要是由mef基因编码所产生的；第三种是核糖体蛋白发生基因突变，导致耐药。 由于与抗生素结合靶位核糖体甲基化，可以导致链球菌对大环内酯类药物、林可酰胺类药物以及链阳菌素B产生交叉耐药性，所以常把这种耐药统称为MLSB耐药表型。甲基化可以导致核糖体50S亚基的构象发生改变，降低结合效率。大环内酯类药物、林可酰胺类药物及链阳菌素B可能有相似的结合位点，产生交叉耐药。根据表达方式的不同，MLS耐药性又可分为内在型(constitutivemacrolidelincosamidestreptogramin，cMLS)和诱导型(induciblemacrolidelincosamidestreptogramin，iMLS)耐药，ermB基因上游调控区决定了ermB的内在或诱导表达。对14、15、16元环大环内酯类药物、林可酰胺类药物及链阳菌素B均耐药，系cMLS型耐药菌；对14、15元环大环内酯类药物耐药，而对16元环大环内酯类药物及林可酰胺类药物及链阳菌素B仍敏感，系iMLS型耐药菌。诱导耐药性仅表现为对大环内酯类药物低水平耐药，一旦耐药基因ermB被完全诱导表达，则表现为内在耐药性，即对所有大环内酯类药物、林可酰胺类药物和链阳菌素B高水平耐药。在肺炎链球菌中发现另一种耐药表型，对14、15元环大环内酯类药物低水平耐药而对16元环大环内酯类药物、克林酰胺类药物和链阳菌素B敏感，即M型，其主要介导主动外排系统产生耐药性。耐药基因mef编码的外排蛋白是一个能量依赖的膜蛋白，由405个氨基酸组成，含12个跨膜区域，mef依靠质子运动力泵出14、15元环大环内酯类药物。另外，在肺炎链球菌中发现核糖体蛋白L4及L22或23SrRNA发生突变，也可以导致其对大环内酯类药物产生耐药性。 本试验从河南、黑龙江、辽宁、广州、上海、湖北、湖南、山东及吉林等全国各地，采集疑似猪链球菌感染猪只病变组织样本1500余份，包括肺、肝、脾、肾、脑、扁桃体及淋巴结等，共分离猪链球菌52株，其中2型猪链球菌3株。用链球菌乳胶凝集试剂盒对分离的猪链球菌进行兰氏分群，其中B群8株，C群1株，D群39株，G群1株，未出现凝集3株，说明在本试验分离株中以D群为主要菌群，占75％。大环内酯类药物耐药菌株的筛选，采用微量稀释法，测定猪链球菌对其敏感性，共分离对大环内酯类药物耐药猪链球菌27株，结果红霉素、泰乐菌素、阿奇霉素和螺旋霉素耐药率分别为53.8％、50.0％、51.9％和53.8％；将筛选出耐大环内酯类药物猪链球菌，采用纸片琼脂扩散法测定该菌对其他抗菌药物敏感度，结果青霉素G和氨苄西林耐药率分别为88.9％和81.5％；氯霉素为59.3％；四环素为96.3％；先锋5号为55.6％；头孢呋新为74.1％；复方磺胺为100％；氟哌酸为81.5％。采用双纸片琼脂扩散法测定猪链球菌耐大环内酯类药物的耐药表型，结果耐药表型均为内在型诱导，即cMLS型耐药表型，未发现iMLS型和M型耐药表型。其中有一株耐大环内酯类药物的猪链球菌检测到ermC基因，有21株耐大环内酯类药物的猪链球菌检测到ermB基因，ermB基因测序结果与Genebank中基因序列同源性均在98％以上，ermC基因测序结果与Genebank中基因序列同源性为99.8％，未检测到mef基因。Erm耐药基因检出率为81.5％，说明引起猪链球菌对大环内酯类药物产生耐药的主要原因是由结合靶位的甲基化引起的。 为阐明猪链球菌在单一药物选择性压力下与复杂选择性压力下，对大环内酯类药物产生耐药机制的不同，以红霉素为代表，本试验采用一株对红霉素敏感的猪链球菌，通过体内和体外诱导耐药试验进行研究。体外诱导耐药试验分为高浓度和低浓度药物诱导组，即将细菌在加有红霉素的培养基内连续传代；体内诱导耐药试验分为治疗组和预防组，即在接种猪链球菌的兔体内进行高浓度和低浓度持续给药，在不同时期分离猪链球菌，分析其耐药性及耐药机制。结果表明，体外诱导耐药试验和体内诱导耐药试验均表明猪链球菌在低浓度红霉素药物溶液的选择性压力下，更容易产生耐药性。将体外诱导试验诱导后的耐药株与空白敏感株，通过电镜观察菌体微细结构，未见异同。猪链球菌体内、体外诱导对红霉素产生耐药性主要是通过ermB基因编码的甲基化酶产生的。猪链球菌的核糖体蛋白发生突变，可能是造成猪链球菌对红霉素耐药的原因之一。 本试验还通过表达ermB基因，寻找核糖体甲基化酶抑制剂，拟解决由于结合靶位改变而导致猪链球菌对大环内酯类药物产生的耐药性，但未成功，有待进一步研究。 本试验首次通过体内和体外诱导耐药试验证明，由于临床药物的不合理使用，特别是在饲料中添加亚治疗量的抗菌药物，这种在持续低浓度抗菌药物对细菌的选择性压力的刺激下，使细菌更加容易产生耐药性。本试验对猪链球菌耐大环内酯类药物的耐药流行性监测及耐药机制的研究，为兽医临床合理用药提供指导，并为新药物的研发提供了新的途径。

目录

文摘

英文文摘

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引言

文献综述

试验研究1猪链球菌的临床分离与鉴定

试验研究 2耐大环内酯类药物猪链球菌的筛选

试验研究3猪链球菌对大环内酯类药物耐药基因检测

试验研究4红霉素对猪链球菌体外体内诱导耐药实验

试验研究5猪链球菌红霉素耐药基因ermB的原核表达

6试验研究结论

致谢

参考文献

攻读博士学位期间发表的学术论文