海藻糖改善枯草芽孢杆菌电转化方法的研究

摘要

基因的转化法是枯草芽孢杆菌进行遗传分析的重要手段。枯草芽孢杆菌是一种含有芽孢的常用的转化外源基因的革兰氏阳性菌。目前，已有多种野生型枯草芽孢杆菌被分离，并且可以产生抗菌物质大概二十多种。这些抗菌物质结构各异，并且可产生多种水解酶。枯草芽孢杆菌所拥有的革兰氏阳性菌表达系统，具有许多革兰氏阴性菌如大肠杆菌不具备的不同蛋白的表达能力，目前，利用基因转化方法转化外源基因已经作为一种现代基因手段广泛用于工业微生物的改良。但是，这些技术的应用基于一个条件，即所用的微生物必须具备可转化的条件。报道表明，造成转化效率过低的原因之一是由于较低的感受态水平。枯草芽孢杆菌感受态的形成是在T0时期，即菌体生长的对数生长期到稳定期。这个过程的控制主要受到两种信息素的调节：ComX和CSF（感受态因子及感受态刺激因子）。这两种信息素的产生及释放与细胞生长的浓度具有协同作用。由于感受态活力低以及一些非自然感受态的原因导致一些微生物不具备转化的条件，之后各国的研究学者陆续发明了其他的转化方法如噬菌体转导，利用细胞融合电转化以及原生质体的电穿孔技术.但是由于大部分野生型的枯草芽孢杆菌感受态水平较低从而难于转化，因此，找到合适的枯草芽孢杆菌感受态时期尤为重要，造成转化效率低的其他原因还有如较小的电场强度，不适合转化的外源基因载体，枯草芽孢杆菌相对较厚的细胞壁及电击后的细胞存活率低等等。因此，寻找到合适的电击保护液用来保护受到电脉冲伤害的细胞并且同时可以增大电场强度以提高转化效率尤为重要。
　　 海藻糖（α-D-glucopyranosyl，α-D-glucopyranoside）是稳定，无色，无味的非还原性双糖，在自然界中广泛分布，尤其是那些具有较强抗脱水作用的生物体，这些生物体甚至在丧失了身体99％水分的情况下仍能生存。早些时候海藻糖被用作碳源，在随后的研究中发现当面对外界压力的反应时会产生海藻糖，研究表明，同其它的寡糖类相比，海藻糖具有最好的水合作用，这说明海藻糖对于稳定双分子细胞膜的水分子排列有作用或者当水分子被除去时可以直接影响生物分子的极性，由此我们推测海藻糖可对在粒子轰击的过程中遭到破坏的细胞起到保护作用，增加细胞存活率从而提高转化效率。
　　 本实验对海藻糖提高Bacillus subtilis168电转化后的存活率及电转化效率进行了研究，目的是为了对难以转化的野生型枯草芽孢杆菌的遗传分析提供一个有效的手段.通过选择最佳的感受态时期并与在电击洗液及恢复培养基中加入较高浓度的海藻糖结合起来，找到了一种有效提高枯草芽孢杆菌转化效率的方法。

目录

文摘

英文文摘

图表索引

第一章 文献综述

1.1 转化的研究及方法

1.2 枯草芽孢杆菌电转化概述

1.2.1 枯草芽孢杆菌的研究进展

1.2.2 电转化的研究进展及应用

1.3 海藻糖的研究与应用

1.3.1 海藻糖的发现

1.3.2.海藻糖的生物活性

1.3.3 海藻糖的制备

1.3.4 海藻糖的应用

1.4 本课题的研究内容和意义

第二章 电转化法转化枯草芽孢杆菌条件的研究

2.1 材料与方法

2.1.1 实验菌株

2.1.2 培养基及试剂

2.1.3 实验仪器

2.1.4 Gang-Ping Xue电转化法的步骤

2.1.5 海藻糖电转化法的步骤

2.1.6 计数

2.2 结果与分析

2.2.1 Gang-Ping Xue电转化法转化Bacillus subtilis 168的效率

2.2.2 生长条件的研究

2.2.3 电击洗液的优化

2.2.4 电击恢复液的优化

2.2.5 电场强度的优化

2.2.6 恢复时间的优化

2.2.7 生长培养基的优化

2.2.8 菌体浓度和温度对转化效率的影响

2.3 讨论

本章小结

第三章 对转化的枯草芽孢杆菌阳性克隆进行鉴定

3.1 材料与方法

3.1.1 实验菌株

3.1.2 仪器

3.1.3 氯霉素序列及扩增引物

3.1.4 培养基及试剂

3.2 实验方法

3.2.1 培养方法

3.2.2 质粒的提取

3.2.3 基因扩增

3.2.4 海藻糖抗性的验证

3.3 结果与分析

本章小结

第四章 海藻糖电转化法的应用

4.1 材料与方法

4.1.1 实验材料

4.1.2 实验方法

4.2 结果与分析

4.2.1 不同质粒的应用

4.2.2 不同菌株的应用

本章小结

全文结论

参考文献

创新摘要

致谢