龙葵多糖分离纯化、结构鉴定及抗H22肿瘤活性研究

摘要

龙葵(Solanum nigrum L.)为茄科茄属植物龙葵的干燥全草,有清热解毒、活血散瘀、利水消肿、止咳祛痰等功效。广泛用于治疗癌症、炎症、痢疾、感冒发热、牙痛、功能性子宫出血、毒蛇咬伤、疔疮、带状疱疹等多种疾病。文献报道,龙葵多糖具有抗肿瘤活性,目前对龙葵多糖的研究侧重于粗多糖,对其均一多糖的化学结构及生物活性的报道稀少,为系统的研究龙葵多糖的化学结构和生物活性,对龙葵多糖进行了分离纯化、理化性质与结构分析及抗肿瘤活性的研究。
　　 本文主要由四个部分组成,包括龙葵多糖的分离纯化、理化性质与结构分析、抗肿瘤活性及作用机制研究。主要工作及研究结果如下:
　　 第一部分:龙葵多糖的分离纯化研究。包括:
　　 1.采用水提和碱提法从龙葵中分别获得水溶性多糖和碱溶性多糖,并对两种多糖进行脱蛋白工艺和脱色研究,结果表明盐酸法脱蛋白效果最好,有高的脱蛋白率和低的多糖损失率。经D-900大孔吸附树脂脱色,脱色率在70％以上。经脱蛋白及脱色处理,获得精制多糖SNLWP和SNLAP,其得率分别为3.87％、6.04％。
　　 2.多糖SNLWP和SNLAP分别经DEAE Cellouse-52离子交换纤维素柱分离,SephadexG-100凝胶柱层析纯化,得到4个主要组分SNLWP-1、SNLWP-2、SNLAP-1和SNLAP-2,它们分别占精多糖总量的51.47％、11.62％、7.79％和34.39％。4个组分经琼脂糖凝胶电泳、SephadexG-100凝胶柱层析、HPGPC3种方法鉴定,表明均为均一多糖。
　　 第二部分:龙葵多糖均一组分理化性质及结构分析。包括:
　　 1.龙葵均一多糖SNLWP-1、SNLAP-1为白色粉末,SNLWP-2、SNLAP-2为淡黄色粉末,4种均一多糖均易溶于水和DMSO。苯酚-硫酸反应、碘-碘化钾反应、斐林反应的鉴定结果表明:4种均一多糖均为非淀粉类多糖,不含有还原性糖。采用HPGPC进行分子量测定,SNLWP-1和SNLAP-1分子量分别为14125和9120,SNLWP-2、SNLAP-2分子量均大于1600000。
　　 2.柱前衍生化-气质联用法测定多糖的单糖组成,结果表明:SNLWP-1由半乳糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖组成,摩尔比为1.8:1:1.2:2。SNLWP-2由半乳糖、葡萄糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖组成,摩尔比为5.4:10.4:1.4:1:1.6。SNLAP-1由半乳糖、葡萄糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖组成,摩尔比为28:1:6:51:13。SNLAP-2由半乳糖、葡萄糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖组成,摩尔比为5.8:1:1.3:2.6:2。
　　 3.红外光谱分析结果表明:4种均一多糖均含有多糖的特征吸收峰,其中SNLWP-1、SNLAP-1、SNLAP-2为β-构型。SNLWP-1、SNLWP-2、SNLAP-1、SNLAP-2由吡喃糖苷和呋喃糖苷组成。
　　 4.刚果红实验结果表明:龙葵均一多糖SNLWP-1、SNLAP-1、SNLAP-2可能存在三股螺旋结构。SNLWP-2则不存在三股螺旋结构。
　　 第三部分:龙葵多糖抗肿瘤活性研究。包括:
　　 1.以H22腹水瘤小鼠为模型,龙葵多糖SNLWP、SNLAP按不同剂量灌胃给药,测定小鼠生存时间、腹腔腹水量、体重及免疫脏器重量,结果表明:两种精多糖均对H22腹水瘤小鼠有一定的生命延长作用,对其恶性腹水有一定的抑制作用,并能提高其免疫脏器指数,且呈剂量依赖关系,并对小鼠体重无明显影响。SNLWP(200 mg/kg·d、100 mg/kg·d)和SNLAP(200 mg/kg·d、100 mg/kg·d)给药组小鼠的生命延长率分别达到66.3％、61.2％和97.4％、63.7％；SNLWP(200 mg/kg·d、100 mg/kg·d)和SNLAP(200mg/kg·d、100 mg/kg·d)对腹水瘤小鼠恶性腹水的抑制率分别为46.2％、30.8％和58.7％、37.4％； SNLWP和SNLAP能显著提高腹水瘤小鼠的脾脏指数和胸腺指数。实验结果表明SNLWP和SNLAP对H22腹水瘤小鼠有抗肿瘤疗效且无毒副作用,其抗肿瘤作用可能与提高免疫功能有关。
　　 2.以H22腹水瘤小鼠为模型,龙葵均一多糖SNLWP-1、SNLWP-2、SNLAP-1、SNLAP-2按不同剂量灌胃给药,测定小鼠生存时间、腹腔腹水量、体重及免疫脏器重量,结果表明:其中SNLWP-1、SNLAP-1和SNLAP-2能显著抑制荷瘤小鼠恶性腹水的生成,延长其生命率,且呈剂量依赖关系,并对小鼠体重无明显影响。SNLWP-1(50 mg/kg·d、100 mg/kg·d)、SNLAP-1(50 mg/kg·d、100 mg/kg·d)、SNLAP-2(50 mg/kg·d、100 mg/kg·d)给药组小鼠的生命延长率分别达到63.5％、36.5％,75.9％、64.2％,88.3％、73.7％。SNLWP—1(50 mg/kg·d、100 mg/kg·d)、SNLAP-1(50 mg/kg·d、100 mg/kg·d)、SNLAP-2(50 mg/kg·d、100 mg/kg·d)对恶性腹水的抑制率分别达到68.7％、57.8％,65.4％、63.6％,69.5％、66.8％。实验结果显示SNLWP-1、SNLAP-1和SNLAP-2对H22腹水瘤小鼠有抗肿瘤疗效且无毒副作用。
　　 第四部分:龙葵多糖抗肿瘤机制研究。包括:
　　 1.以半数抑制浓度(IC50)为指标,采用改良MTT法系统的考察了龙葵水提及碱提精多糖SNLWP、SNLAP,龙葵均一多糖SNLWP-1、SNLWP-2、SNLAP-1、SNLAP-2对小鼠肝癌细胞H22的增殖抑制作用。结果表明,龙葵精多糖及其均一多糖对H22细胞基本无抑制作用。由此可得出,龙葵多糖对H22细胞无直接的细胞毒作用,抗肿瘤作用,可能主要是通过机体自身调节作用,增强机体免疫力而间接抑制或杀死肿瘤细胞。
　　 2.以H22腹水瘤小鼠为模型,龙葵均一多糖SNLWP-1、SNLWP-2、SNLAP-1、SNLAP-2按不同剂量灌胃给药,测定小鼠免疫脏器重量和血清中细胞因子IL-2、IFN-γ和IL-10含量,实验结果显示:SNLWP-1(50 mg/kg·d、100 mg/kg·d)、SNLAP-1(50mg/kg·d、100 mg/kg·d)、SNLAP-2(50 mg/kg·d、100 mg/kg·d)能显著提高腹水瘤小鼠的脾脏指数和胸腺指数。SNLWP-1(100 mg/kg·d)、SNLAP-1(50 mg/kg·d、100 mg/kg·d)、SNLAP-2(50 mg/kg·d、100 mg/kg·d)能显著提高治疗组小鼠外周血血清中IL-2、IFN-γ水平,降低IL-10水平。
　　 IL-2、IFN-γ及IL-10在诱导免疫反应中发挥关键作用,它们对肿瘤细胞无直接毒性,而是通过调节机体免疫系统发挥抗肿瘤效应。IL-2和IFN-γ水平的提高可促进小鼠Th1细胞活化,增强机体免疫力,IL-10水平的降低抑制Th2细胞活化,进而促进Th1细胞活化,也可增强机体免疫力,进而达到抗肿瘤的目的。由此可见促进机体的免疫功能是龙葵多糖抗肿瘤作用的机制之一。
　　 3.对龙葵精多糖及均一多糖进行体外抗自由基作用的研究,结果显示:SNLWP、SNLAP、SNLWP-1、SNLAP-1具有抗O2·-和·OH的双重功效,且呈剂量依赖关系。SNLWP-2、SNLAP-2清除O2·-及·OH作用较弱,但其活性大小也与多糖浓度成正比。龙葵多糖所表现出的抗肿瘤作用可能与其抗氧化活性具有相关性。