盐和低氧胁迫下发芽大豆γ-氨基丁酸富集与调控机理研究

摘要

大豆(Glycine max(L.) Merr.)在我国已有2000多年的栽培与食用历史。大豆富含蛋白质、碳水化合物、维生素和矿物质。大豆种子发芽过程中发生一系列生理生化变化，酶源被激活，酶得以形成，蛋白、碳水化合物等贮藏物质被分解成芽体可利用小分子物质。控制大豆发芽条件，可富集γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）等大豆中原来含量低或不具有的功能成分。植物中GABA主要由GABA支路和多胺降解途径合成，其中谷氨酸脱羧酶(GAD，EC4.1.1.15)和二胺氧化酶(DAO，EC1.4.3.6)分别是这两条途径中合成GABA的限速酶。植物在盐和低氧等胁迫条件下能够强烈激发GAD和DAO活力，导致植物中GABA的显著积累。
　　 本文研究了大豆发芽期间贮藏物质的动员和GABA的动态变化;采用盐和低氧胁迫研究大豆发芽过程中GABA的富集与调控机理，并对盐胁迫、低氧胁迫及其联合对发芽大豆富集GABA及发芽大豆不同部位中GAD、DAO及CaM基因表达水平的差异，ABA对发芽大豆GABA富集及调控机理进行了研究。主要研究结果如下:
　　 1、大豆种子在30℃浸泡4h，可使大豆种子充分吸水，发芽率高，并有利于GABA的富集。随着培养温度的升高和时间的延长，发芽大豆生长加快，呼吸作用增强，可溶性糖含量下降，还原糖、可溶性蛋白、游离氨基酸和GABA含量升高，干物质含量随发芽时间的延长呈下降趋势。相关性分析表明，GABA富集量与芽长、呼吸强度、可溶性蛋白和游离氨基酸具有极显著的正相关(r，0.878～0.943)。综合考虑发芽大豆品质和GABA累积量等因素，大豆在30℃黑暗条件下发芽5d，是生产富含GABA发芽大豆的适宜条件。大豆发芽过程中子叶和胚中GAD和DAO活力均呈现先升高后降低的趋势。发芽3d后，子叶和胚中的GAD活力达到最大值。子叶和胚中DAO的活力分别在发芽5d和4d达到最大值。
　　 2、应用响应面试验研究了NaCl浓度、培养时间和温度对大豆发芽富集GABA的影响，拟合出发芽大豆GABA富集与盐胁迫培养条件之间的回归模型。最优条件是:NaCl浓度133.5 mM、培养时间5.5 d、培养温度为33.3℃，在此条件实测GABA富集量为1.197 mg/g DW。方差分析和验证试验显示，模型可准确的预测盐胁迫下大豆发芽过程中GABA的富集量。最佳通氧处理时机（正常发芽和胁迫处理时间组合）研究表明:优化的胁迫方式是在30℃用去离子水于黑暗条件下培养2d后通气胁迫处理2d。在优化的低氧胁迫时机下进行大豆发芽，其生理生化指标发生显著变化，GABA含量为胁迫前的4.5倍、原料的13.5倍。相关性分析表明GABA含量和其它生理生化指标间相关性极显著。通过响应面分析得到低氧胁迫下发芽大豆富集GABA的最优条件:培养温度30.5℃、培养液pH4.13、通气量0.91 L/min，此条件下GABA富集量为2.65 mg/gDW，是原料的16.6倍。
　　 3、2.5mM的AG处理对发芽大豆芽长和GAD活力无影响，但DAO活力受到极显著抑制;低氧胁迫导致大豆胚中GABA富集量有32％来自DAO活力升高而促进的多胺降解途径。低氧胁迫下，不同浓度的谷氨酸、磷酸吡哆醛、精氨酸、CuCl2，NaCl和CaCl2对发芽大豆中GABA的积累及GAD和DAO活力有显著影响，各自的GABA富集量分别为4.07，3.02，3.50，3.26，4.00和3.30 mg/g DW，均显著高于正常发芽(CK)和低氧胁迫处理(CK0)。大豆子叶和胚中GAD和DAO有不同的活性分布，胚中的酶活力高于子叶。在低氧胁迫下，Glu和NaCl对发芽大豆中GABA富集影响最大，可达到4.07和4.00 mg/g DW。
　　 4、低氧联合盐胁迫下，大豆子叶和胚中GAD活力是单纯低氧胁迫的1.64和1.76倍。在此基础上添加CaCl2，则GAD活力是单纯低氧胁迫的1.80和2.26倍， Glu含量分别比单纯低氧胁迫下降低了44.50％和44.37％，说明Ca2+对GAD活力具有明显的激活作用。低氧联合盐胁迫加入EGTA后，发芽大豆中Ca2+被螯合，阻断了Ca2+与CaM的结合，使GAD活力降低，导致发芽大豆胚中Glu积累。与低氧联合盐胁迫相比，子叶和胚中Glu含量分别提高了18.32％和35.49％。
　　 5、在低氧联合盐胁迫下，发芽大豆子叶和胚中DAO活力比单纯的低氧胁迫提高了36.52％和28.43％，而fPut含量分别比低氧胁迫下降7.15％和37.98％，说明低氧联合盐胁迫促进了腐胺向GABA的转化。低氧联合盐胁迫加CaCl2处理后，发芽大豆子叶和胚中的fPut含量和GAD活力升高。Ca2+提高了GAD活力，使通过GABA支路转化的GABA量提高，作为一种调节，多胺降解途径间接受到抑制，从而使发芽大豆子叶和胚中的fPut得到积累。
　　 6、低氧联合盐胁迫下，GABA的两条富集途径均被加强，发芽大豆子叶和胚中GABA含量是单纯低氧胁迫的1.47和2.00倍，低氧和盐胁迫对GABA的富集具有累加效应。低氧联合盐胁迫下添加AG，发芽大豆子叶和胚中GAD基因表达量分别增加了53.76％和173％，同时CaM表达也发生了相应的变化，说明DAO活力受到抑制时，多胺降解途径受阻，诱导了GAD基因强烈表达，进而补充DAO活力抑制后造成的GABA下降量。低氧联合盐胁迫下胚中5条CaM基因表达均比单纯低氧胁迫高，表明低氧联合盐胁迫促进了CaM基因的表达，进而促进了GAD活力，二者共同引起发芽大豆GABA的富集。低氧联合盐胁迫添加Ca2+后，子叶和胚中GAD基因表达量分别比未添加组增加0.54和2.98倍，低氧联合盐胁迫处理下，Ca2+通过与CaM结合，形成钙调素，促进发芽大豆GAD基因表达，增加了发芽大豆GABA的富集量。
　　 7、低氧联合盐胁迫下，从子叶(Coty)到芽尖(RadⅡ)GAD活力逐渐升高，其中芽尖部分活力是子叶的3.69倍。外源ABA处理使发芽大豆内源ABA和Ca2+含量升高，SCaM1和SCaM2表达增加，显著提高了GAD活力，而Glu含量显著降低。Flu则使内源ABA和Ca2+含量和GAD活力显著降低，并引起Glu的积累。表明发芽大豆内Ca2+浓度受ABA刺激后迅速提高，并使相应的CaM表达增强，从而激活了GAD活力，更多的Glu转化为GABA，引起发芽大豆内Glu的消耗。与对照相比，ABA处理下发芽大豆GAD活力提高，而基因表达水平无显著差异，而Flu处理降低了GAD活力，却提高了GAD基因的表达。表明在低氧联合盐胁迫下，GAD mRNA的表达并不是富集GABA的唯一因素，GAD蛋白的激活可能起主要作用。
　　 8、RadⅠ部分的DAO活力是发芽大豆活力最高的部分，RadⅡ的DAO活力下降，但仍显著高于子叶。在低氧联合盐胁迫下加入ABA后，发芽大豆从子叶到芽尖5部位的fPut和fSpd均比对照增加。发芽大豆胚中DAO基因的表达极显著高于子叶。ABA处理显著提高DAO活力，促进发芽大豆fPut和fSpd的积累。加入Flu后二者含量下降，表明ABA可促进发芽大豆fPut和fSpd的积累。DAO活力增强，多胺积累，二者的联合作用加快了Put向GABA转化，GABA得以富集。低氧联合盐胁迫下加入ABA后，RadⅡ部位DAO表达量下降，其它部位变化无显著差异。Flu处理降低了DAO活力，却促进了DAO基因的表达。胚部GAD活力、DAO活力和GABA含量（以可溶性蛋白计算）均高于子叶，表明胚部是发芽大豆GABA的主要生成部位。

目录

声明

表格索引

图形索引

摘要

缩略词表

第一章 文献综述

1 大豆营养与保健作用

1．1 大豆主要营养成分

1．2 大豆中主要功能成分

1．3 大豆食品生产现状

2 芽类食品的生理及营养成分变化

2．1 芽类食品生理变化及贮藏物质动员

2．2 芽类食品功能物质富集

3 GABA对人体的保健功能

3．1 镇静安神

3．2 降低血压

3．3 调节激素分泌

3．4 神经营养作用

3．5 调节心率失常

3．6 活化肝肾功能

3．7 治疗癫痫与哮喘

3．8 其它功能

4 高等植物中GABA代谢途径

4．1 GABA支路

4．2 多胺降解途径

5 植物富集GABA的机理

5．1 pH调节作用

5．2 Ca2+调节作用

5．3 L-Glu和PLP的作用

5．4 DA0和PAO的作用

5．5 多胺的作用

5．6 Cu2+的作用

6 大豆富集GABA研究进展

6．1 植物浸泡与发芽法富集GABA

6．2 微生物发酵法富集GABA

7 本研究目的意义及研究内容

7．1 本研究目的意义

7．2 主要研究内容

参考文献

第二章 发芽大豆生理活性和GABA等主要物质含量变化

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 主要试剂

1．3 主要仪器设备

1．4 试验方法

1．5 测定指标与方法

1．6 数据处理与统计分析

2 结果与分析

2．1 浸泡对大豆吸水率的影响

2．2 浸泡对大豆发芽率的影响

2．3 浸泡对大豆GABA含量的影响

2．4 大豆发芽过程中芽长变化

2．5 大豆发芽过程中呼吸强度变化

2．6 大豆发芽过程中干物质含量变化

2．7 大豆发芽过程中可溶性糖含量变化

2．8 大豆发芽过程中还原糖含量变化

2．9 大豆发芽过程中可溶性蛋白含量变化

2．10 大豆发芽过程中游离氨基酸含量变化

2．11 大豆发芽过程中GABA含量变化

2．12 发芽大豆生理活性和GABA等物质含量的相关性分析

2．13 大豆发芽过程中氨基酸组成动态变化

2．14 发芽大豆中GAD、DAO活力及GABA时空分布

3 讨论

3．1 浸泡对大豆萌发及GABA富集的影响

3．2 发芽条件对大豆生理活性和GABA富集的影响

3．3 发芽大豆生理活性和GABA等主要物质的相关性

4 本章小结

参考文献

第三章 盐胁迫对发芽大豆GABA富集的影响

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 主要试剂

1．3 主要仪器设备

1．4 试验设计

1．5 测定指标与方法

1．6 统计分析

2 结果与分析

2．1 温度对发芽大豆生长及GABA富集的影响

2．2 盐浓度对发芽大豆生长及GABA富集的影响

2．3 盐胁迫时间对大豆GABA富集的影响

2．4 Box-Behnken试验模型的建立与方差分析

2．5 发芽大豆富集GABA的响应面分析及优化

2．6 模型的验证

3 讨论

3．1 盐胁迫对发芽大豆生理活性的影响

3．2 盐胁迫对发芽大豆GABA富集的影响

4 本章小结

参考文献

第四章 低氧胁迫对发芽大豆GABA富集的影响

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 主要试剂

1．3 主要仪器设备

1．4 试验设计

1．5 测定指标与方法

1．6 统计分析

2 结果与讨论

2．1 通气培养处理对发芽大豆GABA富集量的影响

2．2 低氧胁迫下发芽大豆生理生化变化

2．3 发芽大豆生理活性和GABA等物质的相关性分析

2．4 Box-Behnken试验分析

2．5 培养温度、pH和通气量对发芽大豆GABA含量的影响

2．6 模型的验证

3 讨论

3．1 低氧胁迫对发芽大豆GABA富集的影响

3．2 培养条件对发芽大豆GABA富集的影响

3．3 发芽大豆GABA含量与生理生化指标的相关性

4 本章小结

参考文献

第五章 低氧胁迫下添加物对发芽大豆GABA富集的影响

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 主要试剂

1．3 主要仪器设备

1．4 试验设计

1．5 测定指标与方法

1．6 统计分析

2 结果与讨论

2．1 AG对发芽大豆芽长、GAD、DAO活力和GABA富集的影响

2．2 Glu和PLP对发芽大豆GAD、DAO活力和GABA富集的影响

2．3 Arg和CuCl2对发芽大豆GAD、DAO活力和GABA富集的影响

2．4 NaCl和CaCl2对发芽大豆GAD、DAO活力和GABA富集的影响

2．5 不同添加物对GABA富集效果的影响比较

3 讨论

3．1 GABA支路和多胺途径对发芽大豆GABA富集的影响

3．2 Glu和PLP对发芽大豆GABA富集的影响

3．3 Arg和CuCl2对发芽大豆GABA富集的影响

3．4 NaCl和CaCl2对发芽大豆GABA富集的影响

4 本章小结

参考文献

第六章 低氧联合盐胁迫处理对发芽大豆GABA富集的调控作用研究

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 主要试剂

1．3 仪器设备

1．4 试验设计

1．5 测定指标与方法

1．6 数据处理与统计分析

2 结果与分析

2．1 发芽大豆RNA提取、扩增及测序

2．2 低氧联合盐胁迫下发芽大豆GAD活力变化

2．3 低氧联合盐胁迫下发芽大豆Glu含量变化

2．4 低氧联合盐胁迫下发芽大豆DAO活力变化

2．5 低氧联合盐胁迫下发芽大豆游离多胺含量变化

2．6 低氧联合盐胁迫下发芽大豆GABA含量变化

2．7 低氧联合盐胁迫下发芽大豆子叶GAD、DAO和CaM基因表达分析

2．8 低氧联合盐胁迫下发芽大豆胚中GAD、DAO和CaM基因表达分析

3 讨论

3．1 低氧联合盐胁迫对发芽大豆GABA富集的影响

3．2 GAD、DAO和CaM基因引物和表达方法的选择

3．3 低氧联合盐胁迫对GAD、DAO和CaM基因表达的影响

4 本章小结

参考文献

第七章 低氧联合盐胁迫下ABA对发芽大豆富集GABA的调控机理研究

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 主要试剂

1．3 仪器设备

1．4 试验设计

1．5 测定指标与方法

1．6 数据处理与统计分析

2 结果与分析

2．1 ABA对发芽大豆不同部位内源ABA含量的影响

2．2 ABA对发芽大豆不同部位水溶性Ca2+含量的影响

2．3 ABA对发芽大豆不同部位CaM基因表达的影响

2．4 ABA对发芽大豆不同部位GAD活力的影响

2．5 ABA对发芽大豆不同部位Glu含量的影响

2．6 ABA对发芽大豆GAD基因表达的影响

2．7 ABA对发芽大豆不同部位DAO活力的影响

2．8 ABA对发芽大豆不同部位多胺含量的影响

2．9 ABA对发芽大豆不同部位DAO的基因表达分析

2．10 ABA对发芽大豆不同部位GABA富集的影响

3 讨论

3．1 ABA对发芽大豆内源ABA和Ca2+及CaM基因表达的影响

3．2 ABA对发芽大豆GABA支路富集GABA的影响

3．3 ABA对发芽大豆多胺降解途径富集GABA的影响

4 本章小结

参考文献

全文结论

创新说明

致谢

攻读学位期间发表论文