霍乱弧菌胆盐外排相关基因筛选方法的建立及有氧生长相关蛋白Sco1和C-signal的研究

摘要

霍乱是一种古老且流行广泛的烈性肠道感染疾病，它是由革兰氏阴性细菌霍乱弧菌所引起的。大量的研究表明，霍乱弧菌的致病能力主要是由霍乱毒素和毒素共调节菌毛引起的。
　　 胆盐是胆汁的一部分，在人体内能够帮助消化脂肪。它也是一种去垢剂，能破坏细胞膜从而杀死细胞。霍乱弧菌能够耐受一定浓度的胆盐，说明它有某些基因能够把胆盐外排出细胞或是降解胆盐。本实验采用转座子随机插入基因组的方法筛选到一株对粗胆盐、胆酸钠和脱氧胆酸钠耐受能力显著下降的霍乱弧菌突变株，经基因测序分析发现此基因与文献报道的霍乱弧菌胆盐外排泵一致。说明这种利用转座子随机插入失活来筛选胆盐外排相关基因的方法的建立是可行的，可以通过此体系筛选其他可能存在的胆盐外排相关基因。
　　 细胞色素c氧化酶是电子传递链终端氧化酶，它从细胞色素c得到电子，并把氧气还原成水。铜离子递呈基因sco1编码的Sco1蛋白在酵母、枯草芽孢杆菌等微生物中起到了把铜离子传递给细胞色素c氧化酶的铜离子氧化还原中心的作用。在霍乱弧菌中vca0038为假设的sco1基因。本实通过框内敲除的方法获得该基因的缺失突变株后，霍乱弧菌突变株在LB液体培养基和M9液体培养基中有氧条件下生长速度并未下降，细胞色素c氧化酶氧化能力和对过氧化氢的耐受能力也没有下降。因此，推测该基因对霍乱弧菌的细胞色素c氧化酶氧化能力没有影响。
　　 霍乱弧菌有三套群体感应系统:CqsA/S系统、LuxS/PQ系统和VarS/VarA-CsrA/BCD系统。它们对霍乱弧菌的毒力基因表达等调控作用。群体感应信号分子C-Signal在粘细菌Myxococcus xanthus有氧生长时细胞聚集并形成孢子的过程中起作用。这提示在霍乱弧菌中，假设的C-signal合成基因vc1815的产物对霍乱弧菌的群体感应系统可能有所影响。本实验缺失该基因后，霍乱弧菌突变株的生物膜形成能力并未受明显影响，其毒力共调节菌毛TCP的合成能力也未下降，在乳鼠肠道内的定殖能力也未受到影响，推测该基因对霍乱弧菌群体感应系统可能没有影响。
　　 本实验通过转座子插入失活的方式构建了霍乱弧菌胆盐外排相关基因的筛选方法，并验证了该筛选方法是可行的。同时构建了霍乱弧菌与有氧生长相关的细胞色素c氧化酶基因vca0038和群体感应信号分子C-signal合成基因vc1815的框内敲除突变株。发现vca0038缺失突变株的有氧生长以及细胞色素c氧化酶氧化能力未受明显影响。而vc1815缺失突变株的生物膜形成等与群体感应相关的性状与野生型相比也无明显差别，推测这两个基因可能不影响霍乱弧菌有氧生长情况下的生长。

目录

声明

摘要

文中所用缩写

第一章 文献综述

1．霍乱弧菌的致病机理

1．1 霍乱毒素CT

1．2 毒力共调节菌毛TCP

1．3 霍乱弧菌毒力岛VPI

1．4 霍乱弧菌毒力基因表达的调控

2．霍乱弧菌的群体感应

3．霍乱弧菌胆盐外排基因

4．细菌铜离子递呈蛋白Sco1

5．群体感应信号分子C-signal

参考文献

第二章 霍乱弧菌胆盐外排相关基因的筛选方法的建立

1 材料与方法

1．1 菌株与质粒

1．2 培养基与培养条件

1．3 仪器与试剂

1．4 实验方法

2 结果与分析

2．1 胆盐外排泵基因的筛选

2．2 突变株转座子插入位点侧翼基因的确定

3 小结和讨论

参考文献

第三章 霍乱弧菌铜离子递呈蛋白Sco1的研究

1 材料与方法

1．1 菌株与质粒

1．2 培养基与培养条件

1．3 实验用试剂及仪器

1．4 染色体总DNA的提取

1．5 质粒提取

1．6 大肠杆菌电击感受态细胞的制备及转化

1．7 vca0038缺失菌株的构建

2 结果与分析

2．1 vca0038缺失菌株的构建

2．2 霍乱弧菌vca0038基因的生理功能的研究

3 小结与讨论

参考文献

第四章 霍乱弧菌群体感应信号分子C-signal的研究

1 材料与方法

1．1 菌株与质粒

1．2 培养基与培养条件

1．3 实验用试剂及仪器

1．4 染色体总DNA的提取

1．5 质粒提取

1．6 大肠杆菌电击感受态细胞的制备及转化

1．7 vc1815缺失菌株的构建

1．8 vc1815缺失菌株生物膜形成能力检测

1．9 霍乱弧菌vc1815基因对其毒力共调结菌毛TCP产生的影响

2 结果与分析

2．1 vc1815缺失菌株的构建

2．2 霍乱弧菌vc1815基因的生理功能的研究

3 小结与讨论

参考文献

全文总结

附录 文中所用的试剂和培养基配方

致谢