肠出血性大肠杆菌O157:H7胶体金免疫检测试纸条的制备

摘要

食源性病原微生物是当今食品安全和突发性公共卫生事件的主要诱因，在食源性病原微生物中，肠出血性大肠杆菌(EHEC) O157∶H7是重要的病原之一。本实验旨在制备抗O157∶H7特异单克隆抗体，建立O157∶H7胶体金免疫层析检测方法，为临床快速诊断以及带菌动物、环境污染物和食品等现场检测样品的快速筛查提供简便快速的检测手段。
　　 研究内容分为三个部分:
　　 1.分泌抗大肠杆菌O157∶H7单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立
　　 将E.coli O157∶H7用甲醛灭活超声破碎，免疫BALB/c鼠，制备免疫脾细胞，与SP2/0骨髓瘤细胞融合，建立了7株分泌抗E.coli O157∶H7单克隆抗体(mAbs)的杂交瘤细胞株，分别命名为2E7、2F5、1G9、1D3、2H7、2G11和1C3，Ig亚类分别是IgG2bκ、IgG2aκ、IgMκ、Ⅰ IgMκ、IgG2bκ、IgMκ和IgG2aκ。用间接ELISA检测，1G9和2G11细胞培养上清液的效价为1.6×103，腹水效价均为1×1011;1C3、2E7、2F5、1D3和2H7细胞培养上清液的效价为1×101～2×102，腹水效价均为4×102～1×106。相加ELISA结果显示，1D3和2H7 mAbs对应相同的抗原表位，而其它五株对应不同的抗原表位。用间接ELISA分析特异性，2E7、2H7和1D3为抗EHECO157∶H7特异性单克隆抗体，其它四株mAbs与某些其他血清型的大肠杆菌有交叉反应。Western blotting表明，1C3、1G9、2G11、2E7、1D3和2H7六株mAbs在蛋白分子量约35kD处有特异性条带，而mAbs2F5则未显示蛋白带。
　　 2.大肠杆菌O157∶H7单克隆抗体胶体金免疫检测试纸条的研制
　　 采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液，用纯化的单克隆抗体2E7标记，制备金标抗体玻璃纤维素膜;将纯化的2H7和羊抗鼠IgG分别作为检测和对照捕捉抗体包被于硝酸纤维素膜(NC)上;组装成双抗夹心法O157∶H7胶体金免疫层析检测试纸条。用该试纸条可特异检测EHECO157∶H7，敏感度为106CFU/ml，与相同单克隆抗体2H7和2E7建立的O157∶H7夹心ELISA检测方法的敏感度相当，试纸条简便快速，在1～5 min内可得出检测结果，与EHEC O26∶H11、EHEC O111等其他受试菌株均不反应;敏感性高，特异性强，便于O157∶H7的临床快速诊断与现场检测样品的快速筛查。
　　 3.大肠杆菌O157∶H7胶体金免疫检测试纸条在感染牛和小鼠排菌检测中的应用
　　 为了检验大肠杆菌O157∶H7胶体金免疫层析检测试纸条在感染动物排菌中的应用效果，将牛和小鼠采用灌胃攻毒方式实验感染大肠杆菌O157∶H7，用大肠杆菌O157∶H7胶体金免疫层析检测试纸条、细菌鉴别培养基培养以及PCR3种方法检测感染动物粪便中的O157∶H7的排菌量和持续时间。牛在感染大肠杆菌O157∶H7后的第2d开始从粪便排菌，第4d达到峰值，排菌时间可持续28d;小鼠在感染O157∶H7后的第4h开始从粪便排菌，第6h达到峰值，排菌时间可持续15d。大肠杆菌O157∶H7胶体金免疫层析检测试纸条、细菌鉴别培养基培养计数以及PCR3种方法的检测结果一致，试纸条更简便、快捷、直观，在1～5 min内可得出检测结果，便于现场检测样品中O157∶H7的快速筛查。

目录

声明

摘要

缩略语表(Abbreviation)

大肠杆菌O157：H7病原学及防控技术研究进展

1 病原学

2 流行病学

3 检测技术

4 防控技术

参考文献

第一章 分泌抗大肠杆菌O157：H7单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第二章 大肠杆菌O157：H7单克隆抗体胶体金免疫检测试纸条的研制

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第三章 大肠杆菌O157：H7胶体金免疫检测试纸条在感染牛和小鼠排菌检测中的应用

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

参考文献

全文总结

附录：常用试剂的配制

致谢