江苏地区鲫出血病病原的分离、鉴定及检测方法研究

摘要

鲫（Crassius auratus）与金鱼(Carassius auratus L.)的亲缘关系较近，作为我国淡水养殖的名优品种，养殖规模和养殖潜力越来越大，然而罕有关鲫病毒病方面的报道。鲤科疱疹病毒2型(CyHV-2)，又称为疱疹造血器官坏死病毒（HVHNV）或金鱼造血器官坏死病毒(GFHNV)，是一种可感染金鱼的致病原。1992年秋季和1993年春季在日本西部养殖的金鱼暴发疱疹病毒性造血器官坏死病，造成的死亡率几乎达到了100％，这是有关该病的首次报道。在此之后美国、台湾、澳大利亚、英国和新西兰相继有该疾病暴发的报道。这些报道表明鲤科疱疹病毒2型在金鱼中广泛传播。
　　 2011-2012，国内某些异育银鲫（Carassius aurutus gibelio）养殖的主要产区出现暴发性疾病，发病鱼体表充血腹部肿胀，眼眶基部充血，鳃丝严重出血并发白，肌肉出血，脾肾有程度不一的出血，肝脾肿大，鳔出现点状出血。为查明病因对发病鱼进行病原鉴定分析，显微镜镜检未发现寄生虫感染;用从病鱼病灶组织分离得到的细菌进行人工回染试验，20天内试验鱼无死亡;电镜下观察到发病鱼病灶组织细胞内有大量不同生长期的球形病毒颗粒，病毒粒子有囊膜，直径在90～170nm;提取病鱼组织核酸，鲤春病毒血症病毒(SVCV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)、金鱼造血器官坏死病毒(GFHNV)的特异性引物进行聚合酶链式反应(PCR)，结果只有GFHNV引物扩增出特异性的基因片段，测序结果表明其与GFHNV的参考序列有99％的相似性。用出现典型症状发病鱼的组织上清人工感染健康异育银鲫，试验鱼在3d后陆续发病死亡，患病症状同自然发病症状，并从感染鱼组织中检测到GFHNV;将处理的病样上清液接种在锦鲤鳍条细胞（KF）中7天后出现明显的细胞病变（cytopathic effects，CPE），同时在经过两代盲传后的细胞经过PCR检测也获得了GFHNV阳性目的片段，并在电镜下观察到病毒粒子。根据上述结果，判定本次异育银鲫暴发性疾病病因是GFHNV感染。
　　 为进一步研究病毒特性，作者以典型症状发病鱼组织匀浆液腹腔注射或浸泡对健康异育银鲫进行该病毒生物学特性研究，得出GFHNV的宿主范围包括金鱼和鲫鱼的普通变种，最适感染温度20-25℃;GFHNV对异育银鲫不同鱼龄均有致病力，但幼鱼比成鱼更易感，且死亡高峰期提前。
　　 运用石蜡包埋及制备组织病理切片对患病鲫的鳃、脑、脾、肾、肝胰脏、肠等多个组织进行病理学研究，同时对其治病机理进行初步分析。该病症主要表现为靶器官细胞出现肿胀、变性、增生的坏死现象，部分细胞核出现萎缩、深染，血细胞渗出。
　　 建立了GFHNV的LAMP荧光检测技术，该法的最低检出限4.6×103copies/μL，对锦鲤疱疹病毒、鲤春病毒血症病毒、病毒性神经坏死病毒等无交叉反应，有良好的灵敏性和特异性，可应用于发病异育银鲫早期快速诊断及养殖异育银鲫的病原检测。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 鲫产业概况

1．2 淡水鱼类主要疾病

1．2．1 寄生虫病

1．2．2 真菌病

1．2．3 细菌病

1．2．4 病毒病

1．3 金鱼造血器官坏死病毒研究现状

1．3．1 国内外流行现状

1．3．2 CyHV-2的理化特性

1．3．3 流行病学

1．3．4 临床症状与病理特征

1．3．5 诊断方法研究进展

1．4 研究目的与意义

第二章 异育银鲫出血病病原的分离鉴定

2．1 材料与方法

2．1．1 病毒、实验动物和细胞

2．1．2 试验试剂材料

2．1．3 试验溶液的配制

2．1．4 主要仪器和设备

2．1．5 细菌学检测

2．1．6 寄生虫镜检

2．1．7 病毒学检测

2．1．8 分子生物学鉴定

2．2 结果

2．2．1 临床症状

2．2．2 细菌的分离鉴定

2．2．3 寄生虫镜检

2．2．4 病毒分离情况及人工感染

2．2．5 PCR鉴定和序列分析

2．3 讨论

第三章 GFHNV流行病学特性研究

3．1 材料与方法

3．1．1 实验鱼来源

3．1．2 病毒悬液与对照组注射液的制备

3．1．3 试验鱼人工感染途径

3．1．4 宿主范围试验

3．1．5 温度敏感试验

3．1．6 水花的不同浓度浸泡试验

3．1．7 不同鱼龄异育银鲫易感研究

3．1．8 感染结果的PCR检测及序列测定

3．2 结果和分析

3．2．1 宿主范围

3．2．2 温度敏感性

3．2．3 水花不同浓度浸泡致病力试验

3．2．4 鲫流行病学试验

3．3 讨论

第四章 异育银鲫出血病的病理学观察

4．1 材料与方法

4．1．1 实验用鱼

4．1．2 试剂配置

4．1．3 主要仪器和设备

4．1．4 常规解剖观察

4．1．5 样本组织石蜡切片和H．E．染色

4．1．6 电镜切片的制备

4．2 结果与分析

4．2．1 感染GFHNV异育银鲫的光镜组织病理学研究

4．2．2 感染GFHNV异育银鲫的电镜镜组织病理学研究

4．3 讨论

第五章 病原(GFHNV)环介导等温扩增(LAMP)检测技术的建立

5．1 材料与方法

5．1．1 病毒悬液和病毒核酸

5．1．2 试剂与主要仪器

5．1．3 引物设计与合成

5．1．4 Lamp反应体条件优化

5．1．5 Lamp灵敏度试验

5．1．6 Lamp备选引物特异性试验

5．2 实验结果

5．2．1 Lamp检测反应条件优化结果

5．2．2 灵敏度检测结果

5．2．3 特异性检测结果

5．3 讨论

全文总结

参考文献

致谢

攻读学位期间学术会议、学术交流及发表的学术论文