马铃薯甲虫4个细胞色素P450氧化酶基因的分子克隆及功能验证

摘要

细胞色素P450氧化酶(CYPs)是自然界中最普遍的生物催化剂，可以催化成千上万种反应。昆虫CYPs对于昆虫适应不同的环境有着重要的作用，一方面，CYPs可以氧化多种外源化学物质如杀虫剂、植物次生物质、环境化合物、诱变剂前体等;另一方面，CYPs也参与合成和降解多种内源性物质如甾醇、脂肪酸、信息素、保幼激素和蜕皮激素，在昆虫的整个发育过程中有着非常重要的生理功能。因此，CYPs具有重要的研究价值和潜在的经济价值。
　　本文基于马铃薯甲虫转录组数据和GenBank序列，利用RT-PCR和RACE技术获得了蜕皮激素合成相关基因CYP314A1、新基因CYP412A1、CYP412A2和CYP413A1的全长cDNA序列，并采用RNA干扰和真核表达的方法研究了4个CYPs基因的功能，现将研究结果总结如下:
　　1、马铃薯甲虫4个细胞色素P450氧化酶基因的克隆
　　基于马铃薯甲虫转录组数据和GenBank序列，共鉴定出74个细胞色素P450氧化酶基因。这些基因属于19个家族35个亚家族。利用RT-PCR和RACE技术获得了蜕皮激素合成酶相关基因CYP314A1、新基因CYP412A1、CYP412A2和CYP413A1的全长eDNA序列。分析了这4个基因在不同发育阶段、不同组织中的表达谱。发现这4个基因在马铃薯甲虫的所有发育期和所有组织中均表达，且具有各自特有的时空表达谱。表明这4个基因具有非常重要且各不相同的生理功能，值得进一步研究。
　　2、马铃薯甲虫中4个细胞色素P450氧化酶基因的RNA干扰效应
　　测定了喂食大肠杆菌表达的dsLdCYP314A1、dsLdCYP412A1、dsLdCYP412A2、和dsLdCYP413A1对马铃薯甲虫2龄和4龄幼虫的影响。结果表明，2龄幼虫取食含有上述dsRNA浸渍的叶片后，靶基因mRNA水平显著下降，死亡率明显提高，体重大幅下降，发育历期延长，化蛹率降低，部分幼虫表型异常。4龄幼虫取食后，靶基因mRNA水平显著下降，化蛹率降低。dsLdCYP314A1和蜕皮激素或其类似物氯虫酰肼同时饲喂时，部分或完全补偿了dsLdCYP314A1单独饲喂所产生的不利影响，从而证实了LdCYP314A1的编码产物参与蜕皮激素的合成。
　　3、马铃薯甲虫4个细胞色素P450氧化酶的真核细胞表达与功能验证
　　为明确马铃薯甲虫4个细胞色素P450氧化酶的相关功能，利用昆虫杆状病毒表达系统，分别构建了4个CYPs基因pFastBac1的重组供体质粒pFastBac1-CYP314A1、pFastBac1-CYP412A1、pFastBac1-CYP412A2和pFastBac1-CYP413A1，并利用昆虫细胞系Sf9在体外表达CYPs。蛋白杂交结果显示，Sf9细胞感染重组供体质粒后的细胞裂解液在55 kDa左右均出现了目标条带;同时，感染空载和GFP的细胞裂解液未出现特异性条带，表明4个CYPs基因均成功表达。测定了表达CYP314A1的粗酶液酶活，发现CYP314A1与底物E反应2h后生成的产物经RP-HPLC分离显示具有两个高峰，并且时间与20-羟基蜕皮酮(20E)和蜕皮激素(E)的标准品一样，分别为12 min和15 min;而相同条件下GFP与底物E反应生成的产物经检测仅有一个高峰，洗脱时间与E相同，为15 min。表明CYP314A1在体外成功将底物E催化生成产物20E。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1 马铃薯甲虫的发生和防治

1．1 马铃薯甲虫的起源、传播以及分布

1．2 马铃薯甲虫的防治

2 细胞色素P450氧化酶的研究进展

2．1 细胞色素P450氧化酶的分布

2．2 昆虫细胞色素P450氧化酶基因及蛋白的结构特点

2．3 昆虫细胞色素P450氧化酶的功能

3 RNA干扰的研究进展

3．1 RNA干扰机制

3．2 RNA干扰的方法

3．3 RNA干扰的生物学意义

4 本研究的目的及意义

第二章 马铃薯甲虫细胞色素P450氧化酶基因的分子克隆和表达分析

1 材料与方法

1．1 供试昆虫

1．2 主要试剂和仪器设备

1．3 实时荧光定量PCR

1．4 马铃薯甲虫相关基因片段的筛选和验证

1．5 马铃薯甲虫相关基因片段的全长克隆

1．6 End to End验证

1．7 三氟氯氰菊酯药剂实验

2 结果与分析

2．1 马铃薯甲虫细胞色素P450氧化酶基因的鉴定及农药诱导

2．2 马铃薯甲虫细胞色素P450氧化酶基因的克隆及序列分析

2．3 四种细胞色素P450氧化酶基因的特异性表达

3 讨论

第三章 马铃薯甲虫4个细胞色素P450氧化酶基因的RNA干扰

1 材料与方法

1．1 供试昆虫

1．2 主要试剂和仪器设备

1．3 马铃薯甲虫细胞色素P450氧化酶基因的RNA干扰表达载体的构建

1．4 dsRNA菌液的喂食

1．5 蜕皮激素类似物对RNA干扰的补偿实验

1．6 实时荧光定量PCR反应

2 结果与分析

2．1 细胞色素P450氧化酶基因dsRNA表达载体的构建

2．2 dsLdCYP314A1的RNA干扰效应

2．3 dsLdCYP412A1、dsLdCYP412A2和dsLdCYP413A1的RNA干扰效应

3 讨论

第四章 马铃薯甲虫4个细胞色素P450氧化酶基因的体外表达

1 材料与方法

1．1 主要试剂和仪器设备

1．2 马铃薯甲虫细胞色素P450氧化酶基因真核表达载体的构建

1．3 昆虫细胞Sf9的培养

1．4 重组杆状病毒Bacmid DNA对昆虫细胞Sf9的转染

1．5 SDS-PAGE及Western杂交

1．6 细胞色素P450氧化酶CYP314A1的酶活测定

1．7 细胞色素P450氧化酶CYP314A1的RP-HPLC检测

2 结果与分析

2．1 马铃薯甲虫细胞色素P450氧化酶真核表达载体的构建

2．2 昆虫细胞Sf9感染重组杆状病毒Bacmid DNA后的症状

2．3 Western杂交检测

2．4 细胞色素P450氧化酶CYP314A1的酶活产物分析

3 讨论

全文总结

参考文献

攻读硕士学位期间发表的论文

附录

致谢