IHNV糖蛋白的截短表达及免疫原性检测

摘要

鱼传染性造血器官坏死病(Infectious Haematopoietic Necrosis of fish，IHN)是由传染性造血器官坏死病毒(Infectious Hematopoietic Necrosis Virus，IHNV)引起的一种鲑科鱼类的常见急性病毒性传染病，常造成鱼苗或幼鱼高达50％-100％的死亡率。
　　IHNV囊膜表面有一个糖蛋白(Glycoprotein，G)突起。G蛋白在参与细胞受体与病毒的识别和结合等过程中起着非常重要的作用，并且与病毒的毒力相关。此外，G蛋白还是病毒的主要抗原，存在保护性抗原决定簇，能够诱导机体产生特异性中和抗体。因此，G蛋白及其抗体的制备在IHNV诊断试剂的开发、G蛋白功能的研究及基因工程疫苗的研制中具有重要的作用。
　　我国现行IHNV毒株与欧美等国家的IHNV流行毒株基因型均有所不同，有可能会导致G蛋白免疫原性改变。因此，针对我国IHNV毒株的免疫学检测方法的建立极为必要。而目前，以全长G蛋白为抗原制备的多抗与病毒性出血性败血症病毒(Viral haemorrhagic septicemia virus，VHSV)存在交叉反应。针对上述问题，本研究在生物信息学分析的基础上，对我国现行IHNV毒株G蛋白进行截短表达和抗血清的制备，旨在建立我国现行IHNV的免疫学检测方法。
　　为了深入研究G蛋白的免疫原性，本文通过相关软件分析了G蛋白的跨膜区、抗原性和疏水性后，将G蛋白截短表达。聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE)的结果显示，经过截短后的糖蛋白Gs大小为40kDa，将截短后的糖蛋白进行纯化，用高效液相色谱法(High Performance LiquidChromatography，HPLC)检测其纯度达到90％。使用纯化后的糖蛋白Gs制备兔抗血清，酶联免疫吸附实验法(ELISA)间接免疫荧光结果分析，制备的兔抗血清与IHNV-Sn分离株及参考毒株的反应均呈荧光红色，说明兔抗血清与IHNV能发生特异性的反应。
　　以上实验结果证明表达的Gs蛋白与病毒表面的糖蛋白具有相近的免疫原性，这一结论可以作为重要的实验依据，为建立间接免疫荧光法检测传染性造血器官坏死病和研发截短G基因的DNA疫苗提供帮助。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1 IHNV概述

1．1 IHNV基因型分离株

1．2 IHNV的基因组特征

1．3 IHNV编码蛋白

1．4 IHNV的危害

2 IHN临床症状及流行特点

2．1 病鱼的临床症状

2．2 影响IHNV感染的因素

2．3 IHNV的传播途径

3 检测技术

3．1 细胞培养技术

3．2 免疫学技术

3．3 分子生物学技术

3．4 聚合酶链反应

3．5 环介导等温扩增技术

4 IHN的防治

4．1 感染IHNV后的免疫机制

4．2 疫苗

4．3 免疫佐剂

5 本研究的目的与意义

第二章 IHNV糖蛋白的截短表达

1 仪器与材料

1．1 实验仪器

1．2 实验材料

2 实验方法

2．1 IHNV截短G蛋白基因序列的选择

2．2 IHNV基因组RNA的提取

2．3 逆转录PCR

2．4 PCR产物的纯化与回收

2．5 目的基因连接T载体

2．6 构建pET-27b-Gs重组表达质粒

2．7 Gs蛋白的表达及纯化

3 实验结果

3．1 分析Gs蛋白基因

3．2 Gs蛋白基因的克隆及表达载体的构建

3．3 Gs蛋白的诱导表达

3．4 Gs蛋白的纯化

4 讨论

4．1 G蛋白目的基因片段的选择

4．2 表达载体的选择

4．3 包涵体

第三章 IHNV截短糖蛋白的免疫原性检测

1 仪器与材料

1．1 实验仪器

1．2 实验材料

2 实验方法

2．1 兔抗血清的制备

2．2 IHNV-Gs蛋白抗血清效价的检测

2．3 间接免疫荧光(IFA)检测

3 实验结果

3．1 IHNV-Gs蛋白抗血清效价的检测

3．2 间接免疫荧光检测免疫原性

全文总结

参考文献

致谢

附录