猪肠道菌群对乳酸的利用和D型乳酸利用菌的分离、鉴定及代谢研究

摘要

高等哺乳动物后肠道中栖息着种类众多的微生物，数量高达1013-1014 CFU/mL，这些微生物的代谢活动对维持肠道健康起着重要作用。一些肠道微生物，如乳酸杆菌、双歧杆菌和肠球菌等代谢会产生大量乳酸，主要为两种构型:L型乳酸和D型乳酸，其中D型乳酸的积累会对动物产生严重后果。实际上，在健康动物的粪样中乳酸的浓度很低，这是因为乳酸可以被消化道内的其他菌群代谢所利用。这些细菌不仅可以代谢消化道内过量的乳酸，防止乳酸酸中毒，维持正常pH，而且可以产生大量短链脂肪酸（Short chain fatty acids，SCFAs），其对维持大肠的健康有重要作用。目前，关于单胃动物肠道中乳酸利用菌的报道尚不多，特别是在猪源D型乳酸利用菌方面还未见系统研究，因此，本论文首先对猪粪样中混合菌群利用不同构型乳酸的特性进行了初步探讨，进一步分离和鉴定粪样中的D型乳酸利用菌，并研究其体外发酵特性。论文研究分为三部分:
　　一、仔猪粪样菌群对不同构型乳酸的体外利用特性
　　本试验旨在比较猪粪样中菌群对不同构型乳酸的利用特性，分别以D型乳酸、L型乳酸或DL型混合乳酸为底物，仔猪新鲜粪样为接种物进行体外发酵试验。测定发酵过程中乳酸的浓度，并用高通量测序技术分析发酵前、后发酵液中菌群变化。结果表明，发酵24 h后，添加不同构型乳酸时，在门水平上，发酵样品中菌群组成无显著差异，在属水平上菌群组成有显著变化，D型乳酸组Coprococcus、Subdoligranulum属占总菌比例显著低于L型和DL型混合乳酸组，而Ruminococcus、unclassifiedClostridiales和unclassified Lachnospiraceae占总菌比例显著高于其他两种底物组(P＜0.05)。24 h后，发酵液中Coprococcus、Desulfovibrio和Oscillibacter属被10倍以上富集，而Blautia、Clostridium、Dorea和Faecalibacterium属占总菌比例仅为发酵前的0.1-0.5。结果表明，猪粪样微生物对不同构型乳酸的利用存在差异，乳酸在后肠道中的积累和菌群之间的互作有关，调节微生物菌群组成可能是防止乳酸积累的一个有效途径。
　　二、猪源D型乳酸利用菌的分离与鉴定
　　本试验旨在分离猪源D型乳酸高效利用菌，并通过生理生化实验和分子手段对其进行鉴定。将新鲜猪粪接种到只补充D型乳酸的YCFA培养基，在厌氧条件下培养，共分离纯化得到25株肠道菌。通过测定25株菌24 h内对D型乳酸的利用情况，筛选到6株高效利用D型乳酸的菌株:J1、J2、J3、J4、J5、J6，它们在24 h内对25 mmol/L的D型乳酸利用率均接近100％。通过对D型乳酸利用菌的生理生化和16S rRNA基因序列进行鉴定，6株菌分别被鉴定为:Bacteroidesfragilis（脆弱拟杆菌），为拟杆菌属的代表株，革兰氏阴性杆菌;Bacteroides acidifaciens（产酸拟杆菌），此菌株与脆弱拟杆菌的特性相似;Veillonella denticariosi，系统发育与啮齿韦荣氏球菌相似;Veillonella caviae（豚鼠韦荣氏球菌），革兰氏染色阴性厌氧球菌;Bacteriodies uniformis（单形拟杆菌），革兰氏染色为阴性，无芽孢，专性厌氧型;Megasphaera elsdenii（埃氏巨型球菌）。6株菌均能利用葡萄糖、麦芽糖、乳酸等碳源并产生大量的气体。
　　三、D型乳酸利用菌的体外发酵性质以及对不同构型乳酸利用的研究
　　本试验旨在研究6株D型乳酸利用菌对D型乳酸的体外发酵特性以及Megasphaera elsdenii J6对不同底物的发酵特性。将6株菌分别接种到补充25 mmol/LD型乳酸的YCFA培养基上生长，测定其24 h生长速率，对底物的利用情况以及发酵产物，6株菌均能在仅添加D型乳酸的培养基上生长良好，并且都可以在24 h内完全利用掉25 mmol/L的D型乳酸，产生大量SCFAs。其中，Megasphaera elsdenii J6对D型乳酸的利用速率最快，并且24 h的发酵产物中丁酸的产量远高于其它5株菌。将M.elsdenii J6接种到分别添加相同浓度(25 mmol/L)的D型乳酸、L型乳酸、DL型混合乳酸（D型乳酸:L型乳酸分别为1∶1和1∶2）以及葡萄糖的培养基上生长，结果表明:相对于L型乳酸，M.elsdenii J6更偏爱利用D型乳酸。当M.elsdenii J6生长在D型乳酸为唯一底物的培养基上时，代谢产物中乙酸、丙酸、丁酸、戊酸等短链脂肪酸的浓度显著高于生长在其他构型乳酸的培养基上(P＜0.05)。测定M.elsdeniiJ6的D型乳酸脱氢酶的活性显著高于L型乳酸脱氢酶的活性(P＜0.05)。当M.elsdeniiJ6生长在仅添加葡萄糖为底物的培养基上时，M.elsdenii J6首先将葡萄糖代谢为乳酸，当葡萄糖消耗殆尽之后M.elsdenii J6利用已经产生的乳酸进行二次发酵，说明菌株M.elsdenii J6自身存在一个初级和次级代谢的关系。该结果说明，优先利用D型乳酸的肠道细菌，如M.elsdenii，对肠道内D型乳酸积累有潜在的益生调控作用。

目录

声明

摘要

引言

文献综述

1 单胃动物消化道微生物区系及其对宿主健康的影响

1．1 消化道微生物区系

1．2 单胃动物胃肠道内微生物的组成

1．3 微生物区系对宿主健康的影响

2 乳酸代谢机制

2．1 乳酸的生成与代谢

2．2 乳酸酸中毒

3 肠道内乳酸利用，丁酸产生菌种类及分布

4 研究内容、目的和意义

参考文献

试验一 仔猪粪样菌群对不同构型乳酸的体外利用特性

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

1．3 统计方法

2 试验结果与分析

2．1 猪粪样微生物对不同浓度不同构型乳酸的利用特性

2．2 24h发酵液中菌群组成

3 讨论

参考文献

试验二 猪源D型乳酸利用菌的分离与鉴定

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

2 结果与分析

2．1 细菌分离

2．2 乳酸浓度测定

2．3 细菌的形态鉴定

2．4 细菌的生化鉴定

2．5 分子生物学鉴定

3 讨论

参考文献

试验三 D型乳酸利用菌的体外发酵性质以及对不同构型乳酸利用的研究

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

1．3 统计方法

2 结果与分析

2．1 D型乳酸的利用特性

2．2 Megasphaera elsdenii J6菌株对不同底物的利用特性

3 讨论

参考文献

全文结论

发表学术论文

致谢

附录