红曲菌肉品发酵菌株筛选、鉴定及其酸性蛋白酶功能特性研究

摘要

红曲菌(Monascus spp.)是我国重要的食用微生物资源，将其及其代谢产物应用于发酵食品可显著改善产品的品质和风味，在我国具有悠久的应用历史。红曲菌生长过程中可产生红曲色素(Monascus pigments，MPs)、莫纳可林K(Monacolin K)、γ-氨基丁酸、dimerumic acid以及一些有机酸和蛋白酶等，其中MPs能显著改善食品色泽，蛋白酶等是发酵食品风味形成的关键因素。关于红曲菌的应用研究主要集中在植物源发酵食品的生产，将红曲菌作为肉品发酵剂的研究较少，仅在红曲菌代谢产物如MPs、dimerumic acid等对发酵肉制品品质及功能方面的影响有报道。为更好地将红曲菌及其代谢产物应用于发酵肉制品的加工，本研究开展红曲菌肉品发酵菌株筛选，对其所产酸性蛋白酶组分进行分离、纯化和酶学特性研究，并探讨该酸性蛋白酶组分对肌肉蛋白的降解规律及对肌肉品质的影响。主要研究内容和结果如下:
　　1.红曲菌肉品发酵菌株优选及鉴定
　　对12株不同种属的红曲菌在不同纯培养条件下(PDB液态培养基、米饭固态培养基)进行初筛，以液态培养物中色素含量、酸性蛋白酶酶活和固态培养物中桔霉素含量为检测指标，筛选到产色素和酸性蛋白酶能力较强，且不产或低产桔霉素的2株红曲菌M J-1和As3.549。模拟肉品加工条件构建体外筛选体系对初筛菌株进行优选，以培养物中菌丝体干重、色素含量、发酵液pH值和酸性蛋白酶酶活为考察指标，对M J-1和As3.549进行肉品发酵菌株优选，结果表明:2株红曲菌在25～50 g/L的NaCl、0.1～0.3 g/L的NaNO2、1～5 g/L的多聚磷酸钠含量和以葡萄糖或蔗糖为碳源的系列培养物中，M J-1的菌丝体干重、色素产量和酸性蛋白酶酶活均显著高于As3.549(p＜0.05)。以上结果说明，M J-1对肉品加工条件的耐受性优于As3.549，是理想的红曲菌肉品发酵菌株。采用形态学结合ITS序列分析的方法对MJ-1进行鉴定，MJ-1的ITS、ITS1及ITS2序列的聚类分析显示，MJ-1序列均能与红色红曲菌（Monascus ruber）聚在一起，结合形态学观察结果，确定M J-1为红色红曲菌。
　　2.红色红曲菌MJ-1对发酵猪肉糜品质的影响
　　将MJ-1接种猪肉糜发酵，跟踪测定猪肉糜发酵过程中色泽、TBARs、TVBN、蛋白酶酶活、MFI、FAA和肌肉蛋白SDS-PAGE电泳等指标的变化，并利用HPLC和 LC-MS对发酵结束猪肉糜内桔霉素、生物胺含量进行检测，结果表明:接种MJ-1的猪肉糜发酵过程中a*值、MFI值、FAA总量和酸性蛋白酶酶活均显著上升(p＜0.05)，TBARs值显著下降(p＜0.05)，TVBN值上升较慢(p＞0.05)，发酵结束后达到最高值(6.82 mg/100 g猪肉糜)，仍在新鲜标准内(≤25 mg/100 g)，SDS-PAGE电泳表明猪肉糜发酵过程中肌肉蛋白发生了明显降解。在发酵结束的猪肉糜中未检测到桔霉素，总生物胺含量达到79.26 mg/100 g，毒性较大的组胺和酪胺分别为4.12 mg/100g、3.68mg/100g，均低于FDA标准。上述结果说明:接种MJ-1发酵能显著改善猪肉糜色泽，抑制脂肪氧化和腐败，促进肌肉蛋白降解和FAA生成。在发酵结束猪肉糜中未检测到桔霉索，生物胺总量、组胺和酪胺含量均在安全范围内，因此将M J-1用于肉品加工中是安全的。
　　3.红色红曲菌M J-1酸性蛋白酶分离、纯化及酶学性质研究经硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose CL-6B离子交换和Sephacryl S-200分子筛凝胶过滤层析，从红色红曲菌M J-1粗酶液中分离、纯化到1种酸性蛋白酶组分，比活力达到58.57 U/μg，纯化了12.28倍，酶活回收率为5.13％。SDS-PAGE电泳表明该酸性蛋白酶分子量为51 KDa，且无亚基是单体酶。利用质谱技术对该酸性蛋白酶进行序列分析，该酶与紫色红曲菌所产酸性蛋白酶(Accession number BAC97797.1)的同源性达到95％，有7段肽段匹配，匹配分值达到744分。圆二色谱结果显示该酸性蛋白酶二级结构中α-螺旋占84.3％，无规卷曲占15.7％，不存在β-折叠和回转，说明该酸性蛋白酶热稳定性相对较差。该酶在pH3.0，40℃时催化能力最强，在pH3.0～5.0，温度30℃～50℃范围内具有较好的稳定性。以酪蛋白为底物对该酸性蛋白酶进行动力学分析，确定该酶的Km和Vmax分为1.3 mg/mL、44.05μg/mL·min，说明该酶对动物源的酪蛋白有较强的底物亲和力。Mn2+、Mg2+、2-巯基乙醇和DTT对该酶的酶活有较明显的激活作用， Ag+、Fe3+、PMSF、EDTA和EGTA对酶活有较明显的抑制作用，Cu2+、Ca2+，Fe2+和Na+对酶活影响不明显。
　　4.红色红曲菌M J-1酸性蛋白酶降解肌肉蛋白规律及对肌肉品质的影响
　　通过SDS-PAGE电泳考察MJ-1酸性蛋白酶对肌原纤维蛋白和肌浆蛋白的降解情况，结合该酶处理的肌肉组织扫描电镜结果，研究该酶对肌肉蛋白的降解规律。对比MJ-1酸性蛋白酶、菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶处理后的肌肉组织肌纤维直径、MFI值、肌肉剪切力和肌肉组织加压失水率等指标的差异，进一步研究MJ-1酸性蛋白酶对肌肉品质的影响。结果表明:肌原纤维蛋白中190 KDa的重链肌球蛋白条带在酶解30 min后完全消失，43 KDa处肌动蛋白及其以下的蛋白条带在酶解10 min时开始变弱，但在酶解过程中没有消失，97.4 KDa处在酶解10 min后出现新的条带，且随着酶解时间延续不断增强;肌浆蛋白在整个酶解过程中没有变化;扫描电镜下酶解后的肌肉组织横截面变疏松，有大量肌肉纤维断裂现象;应用M J-1酸性蛋白酶处理后的肌肉组织剪切力、肌纤维直径和MFI值等嫩化结果均接近于菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶处理组，但肌肉加压失水率显著高于菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶处理组(p＜0.05)。以上结果说明，该酸性蛋白酶主要降解肌肉肌原纤维蛋白中的重链肌球蛋白，部分降解肌动蛋白，对肌浆蛋白没有降解作用。采用该酶处理肌肉组织能显著改善肌肉的嫩度、色泽和保水性。

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摘要

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第一章 文献综述

1 立题背景

2 国内外霉菌发酵肉制品研究现状

2．1 发酵肉制品表面霉菌区系研究

2．2 霉菌发酵剂菌株筛选

2．3 霉菌发酵剂对发酵肉制品风味形成的影响

2．4 霉菌发酵剂对肌肉蛋白质的降解作用

2．5 霉菌发酵剂对脂肪的水解作用研究

2．6 霉菌发酵剂应用于发酵肉制品加工中的安全问题

3 红曲菌(Monascus spp．)在肉制品中的应用

3．1 红曲菌概述

3．2 红曲菌的鉴定方法

3．3 红曲菌及其代谢产物在肉制品加工中的应用研究进展

4 本研究的意义和主要研究内容

4．1 研究意义

4．2 主要研究内容

参考文献

第二章 红曲菌发酵菌株优选及菌种鉴定

1 引言

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．2 实验方法

3 结果与讨论

3．1 红曲菌株初步筛选

3．2 红曲菌MJ-1和As 3．549肉品发酵菌株优选

3．3 不同碳源对红曲菌发酵特性影响

3．4 红曲菌MJ-1菌种鉴定

4 本章小结

参考文献

第三章 红色红曲菌MJ-1对发酵猪肉糜品质的影响

1 前言

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．2 实验方法

3 结果与讨论

3．1 红色红曲菌MJ-1发酵猪肉糜加工过程中品质变化

3．2 蛋白酶酶活及肌肉蛋白质降解变化

3．3 红色红曲菌MJ-1发酵肉糜安全性指标检测

4 本章小结

参考文献

第四章 红色红曲菌MJ-1酸性蛋白酶分离、纯化及酶学特性研究

1 前言

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．2 实验方法

3 结果与讨论

3．1 硫酸铵最适添加量的确定

3．2 红色红曲菌MJ-1酸性蛋白酶的分离、纯化

3．3 红色红曲菌MJ-1酸性蛋白酶质谱序列分析

3．4 红色红曲菌MJ-1酸性蛋白酶酶学特性研究

4 本章小结

参考文献

第五章 红色红曲菌MJ-1酸性蛋白酶降解肌肉蛋白规律及对肌肉品质的影响

1 前言

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．2 实验方法

3 结果与讨论

3．1 红色红曲菌MJ-1酸性蛋白酶对肌肉蛋白质的降解规律研究

3．2 红色红曲菌MJ-1酸性蛋白酶处理对肌肉品质的影响

4 本章小结

参考文献

全文结论

论文创新点

致谢

攻读博士期间发表论文情况