巨大芽孢杆菌X-1谷氨酸脱羧酶及γ-氨基丁酸转化条件的研究

摘要

γ-氨基丁酸（又为氨酪酸GABA）广泛分布于动、植物体中，是人和动植物体内一种非常重要的非蛋白质类氨基酸。GABA是动物中枢神经系统中一种有效的抑制性神经递质，具有镇静、抗惊厥、降血压、抗癫痫、增进脑活力、保肝利肾、营养神经细胞、促进生长激素分泌等功能。此外，GABA还能在非神经组织申发挥激素调节或营养因子的功能，对动物体正常的生理功能起着重要的调节作用，因而在医药及食品领域具有巨大的市场前景。目前GABA已被批准为新资源型食品添加剂，在烘焙食品、乳制品、饮料等制品中被广泛使用。
　　谷氨酸脱羧酶(GAD)是生物合成GABA的关键酶，通过催化L-谷氨酸发生脱羧反应，生成GABA。该酶在低等和高等生物中都可发现。因微生物发酵产GABA不受资源、环境的约束，且生长条件简单、速度快、成本低，相对于植物富集和化学合成法，具有更广阔的应用前景。
　　目前多种微生物中都有GAD的存在，如大肠杆菌、酵母菌、霉菌、乳酸菌等，但这些微生物的GAD均为胞内酶，提取纯化困难，且活力不高，因而不利于工业化生产。而芽孢杆菌作为一种新型药用价值化合物产生菌，自1971年首次报道能产GABA以来，研究甚少。故本文主要对产GABA的芽孢杆菌进行筛选，并对其进行发酵工艺条件的优化以及谷氨酸脱羧酶基因的克隆表达，旨在通过发酵工艺条件的优化和基因工程技术的手段提高GAD酶活，为GABA的生产和应用奠定基础。主要研究结果分述如下:
　　1.产γ-氨基丁酸芽孢杆菌的筛选与鉴定。从不同来源的土壤样品中分离出326株菌，通过纸层析法初筛和高效液相色谱法复筛，从中筛选出3株产GABA的菌株。其中菌株X-1为芽孢杆菌，GABA含量为4.46 mmol/L。通过对其形态特征、生理生化特征进行鉴定，初步判断该菌株为巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）。对菌株X-1的16S rDNA进行PCR扩增和序列测定，并利用GenBank数据库进行同源比对，构建系统发育树，发现菌株X-1的16S rDNA(序列NR074290)与巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)的16S rDNA序列同源性达99％，亲缘关系最近。结合菌株X-1的形态特征、生理生化特征，表明菌株X-1在细菌系统分类学上属于巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium），并命名为B.megaterium X-1。
　　2.B.megaterium X-1产γ-氨基丁酸发酵工艺条件的优化。首先，通过单因素实验对发酵培养基成分进行优化，确定影响GABA产量的关键因子为葡萄糖、蛋白胨、K2HPO4和磷酸吡多醛(PLP)，并通过正交实验，确定最佳培养基成分为葡萄糖30.0 g/L、蛋白胨30.0 g/L、K2HPO40.6 g/L、PLP0.3 g/L、L-谷氨酸钠(L-MSG)10.0 g/L、NaNO33.0 g/L、MgSO4·7H2O0.5 g/L、FeSO4·7H2O0.01 g/L。其次，对其发酵条件进行单因素实验，确定影响GABA产量的关键因素为接种量、pH、发酵温度和转速，并通过田口实验，确定产GABA的最佳发酵条件为接种量2％、pH6.0、发酵温度30℃、转速180 r/min。在此条件下，发酵液中GABA浓度为22.07±1.03mmol/L，比优化前提高了3.94倍。
　　3.B.megaterium X-1 GAD基因的克隆与表达。首先，以B.megaterium X-1基因组DNA为模板，运用PCR技术扩增GAD基因，并克隆到pMD19-T载体上，构建克隆载体pMD-gadB，经测序正确后，将gadB与表达载体pET-30a连接，构建重组表达质粒pET-30a-gadB，并将其转化到E.coli BL21(DE3)中，通过IPTG的诱导，实现pET-30a-gadB的表达，酶活为10.13 U/mL。其次，对重组菌的表达条件进行研究，重组菌在接种量3％、IPTG浓度0.2 mM、温度55℃、诱导时间为12h的条件下，酶活最高，达到15.12 U/mL。最后，对重组酶进行分离纯化，SDS-PAGE电泳显示该酶分子量约为53 KDa。通过对酶学性质的研究，发现该酶最适温度45℃，最适pH3.5，在温度45-55℃、pH3.0-4.5的范围内该酶较稳定，其Km、Vmax分别为13.10 mM、201.65U/mg。
　　4.重组大肠杆菌细胞制备γ-氨基丁酸转化条件的研究。通过对细胞制备GABA的转化温度、pH、表面活性剂、生长因子、金属离子和底物浓度的研究，确定制备GABA的转化条件为温度55℃、pH3.5、PLP0.02 mM、L-MSG125 mmol·L-1，GABA的转化效率为22.01±1.26 g/g·h。

目录

声明

表格索引

图形索引

摘要

第一章 文献综述

1 GABA的生理功能和应用

1．1 抑制性神经递质

1．2 营养神经

1．3 调节血压

1．4 治疗精神疾病

1．5 辅助治疗哮喘

1．6 促进睡眠，增强记忆力

1．7 抗衰老

1．8 GABA的其它功能

2 γ-氨基丁酸的来源与应用

2．1 GABA的来源

2．2 GABA的应用

2．3 GABA的制备

3 微生物谷氨酸脱羧酶的研究进展

3．1 微生物GAD的来源及分布

3．2 微生物GAD的催化活性

3．3 微生物GAD的基因克隆与表达

4 课题研究的目的、意义和主要内容

参考文献

第二章 γ-氨基丁酸产生菌的筛选及鉴定

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 GABA产生菌的分离筛选

2．2 菌株的形态及生理生化特征鉴定

2．3 16S rDNA序列分析鉴定

3 讨论

4 本章小结

参考文献

第三章 B．megaterium X-1发酵工艺条件的优化

1 材料和方法

1．1 主要实验材料

1．2 分析方法

2 结果与分析

2．1 B．megaterium X-1生长曲线和产酶曲线

2．2 培养基成分优化

2．3 发酵条件优化

3 讨论

4 本章小结

参考文献

第四章 B．megaterium X-1谷氨酸脱羧酶基因的克隆与表达及酶学性质的研究

1 材料和方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 目的基因的扩增

2．2 克隆载体的鉴定

2．3 序列测定

2．4 重组质粒的酶切验证

2．5 重组酶表达的SDS-PAGE鉴定

2．6 重组酶表达条件的研究

2．7 重组酶表达的纯化

2．8 重组酶酶学性质研究

3 讨论

4 本章小节

参考文献

第五章 重组大肠杆菌细胞制备γ-氨基丁酸转化条件的研究

1 材料和方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 温度对重组大肠杆菌细胞制备GABA的影响

2．2 pH对重组大肠杆菌细胞制备GABA的影响

2．3 底物浓度对重组大肠杆菌细胞制备GABA的影响

2．4 表面活性剂及生长因子对重组大肠杆菌细胞制备GABA的影晌

2．5 PLP对重组大肠杆菌细胞制备GABA的影响

2．6 不同金属离子对重组大肠杆菌细胞制备GABA的影响

3 讨论

4 本章小结

参考文献

全文结论

创新点

攻读硕士期间发表的论文

致谢