棉花膜联内切beta-1,4-葡聚糖酶基因GhKOR1的功能分析

摘要

棉花是世界上最重要的天然纺织原料，同时也是重要的油料作物。棉花种子表皮细胞会发育为棉纤维，而在种子内部会有大量的油分及蛋白质合成。在成熟的棉花种子中，油分及蛋白分别占种子总质量的21％和23％，从而使棉花成为世界上第五大产油作物及第二大产植物蛋白作物。同时，作为棉花种子的一部分，棉纤维的生长会受到种子发育的影响。对棉花种子的研究不仅对提高种子的产量、品质及最终产品的价值具有重要意义，而且可能为棉纤维产量和品质遗传工程改造提供理论依据。
　　实验室前期通过同源克隆的方法，从陆地棉纤维cDNA文库中获得了一个与纤维素合成相关的编码619个氨基酸的cDNA克隆，命名为GhKO1(Gossypium hirsutum，Genbank No.AY574906)。本研究即在此基础上对GhKOR1基因进行更深入的结构与功能研究。该基因编码一个糖基水解酶超家族9蛋白，蛋白预测显示该蛋白存在一个由23个氨基酸组成的跨膜结构域。与其它作物同源基因的氨基酸序列比对结果表明，GhKOR1蛋白包含该类催化蛋白所具有的定位信号序列、催化活性位点及糖基化位点。将GhKOR1与拟南芥AtKOR1基因组序列比对，发现两者具有相同的内含子和外显子数目，外显子中核苷酸数目也相似。以上分析表明，GhKOR1基因在棉花中编码KOR蛋白。通过RT-PCR及qRT-PCR方法分析GhKOR1基因在棉花不同组织中的表达模式，结果表明，GhKOR1基因在棉花根、茎、叶、不同时期棉纤维及胚珠、种皮和子代组织中都表达，说明GhKOR1基因为一个组成性表达的基因，对细胞的生长发育具有组成性的功能。
　　利用反向遗传学技术，对GhKOR1基因在棉花种子及纤维发育过程中的功能进行了研究。利用pCAMBIA-1301和pCAMBIA-1302载体，分别构建了GhKOR1基因的过量表达载体和干扰表达载体，通过农杆菌介导的遗传转化方法将上述载体导入棉花W0品系进行转基因功能验证。通过对每个再生单株进行潮霉素标记基因和启动子基因特异引物的PCR检测，共获得8个干扰表达载体转基因株系和3个正义过量表达载体转基因株系。对GhKOR1基因在转基因株系中进行了初步表达分析，结果表明，在8个干扰载体转基因株系中，有6个转基因株系发生了RNAi作用，GhKOR1基因表达量显著降低;在3个过量表达载体转基因株系中，没有检测到GhKOR1基因过量表达的转基因株系，其中1个转基因株系发生了共抑制作用，GhKOR1基因表达量显著降低。进一步选取三个GhKOR1基因抑制表达的转基因株系RNAi line1、RNAi line5和Co-S line1作为研究对象进行下一步深入研究。
　　首先，对GhKOR1基因在棉花种子发育过程中的作用进行了研究。RT-PCR及qRT-PCR分析表明，与野生型相比，GhKOR1基因在转基因林系子代组织及种皮中的表达量显著降低;而其同源基因GhKOR2在转基因株系中的表达量没有显著性变化。通过对20 DPA胚珠的显微观察及生物量测定表明，三个转基因株系中胚胎和胚乳的发育都受到了影响，两者都变小并且发育延迟。纤维素含量分析表明，转基因株系20DPA种皮中的纤维素含量显著降低。通过超薄切片及染色技术对转基因株系10 DPA的种子进行分析。结果表明，与野生型相比，转基因株系胚乳细胞的细胞化过程受到影响，胚乳细胞明显变少，且细胞壁不完整;胚胎发育过程也受到抑制，转基因株系胚胎发育延迟。通过对15 DPA种皮的超薄切片分析表明，与野生型相比，转基因株系种皮转运细胞中胼胝质的含量明显降低，而纤维素含量没有显著变化。进一步的qRT-PCR分析表明，GhKOR1基因在转基因株系15 DPA种皮中的表达量明显降低，同时，参与胼胝质代谢的一个beta-1，3-葡聚糖酶基因GhGlu3的表达量也明显降低。推测GhGlu3基因表达量的降低是由于与GhKOR1基因发生共抑制现象而产生的。进一步对转基因株系种子及幼苗活力分析，结果表明，与野生型相比，转基因株系成熟种子的百粒重显著降低，种子的萌发时间显著变长，而幼苗的活力也显著降低。GhKOR1基因在转基因幼苗根部及地上组织中的表达也显著降低。推测转基因种子及幼苗活力的降低可能是由于其种子发育过程受到损害而导致的。
　　其次，对GhKOR1基因在棉纤维发育过程中的作用也进行了研究。RT-PCR及qRT-PCR分析表明，GhKOR1基因从棉纤维伸长期开始高表达，至少持续到25 DPA。进一步的分析表明，与野生型相比，GhKOR1基因在转基因株系10 DPA和20 DPA棉纤维中的表达量显著降低。转基因株系棉纤维长度及纤维素含量显著降低，同时，棉纤维在单个棉铃及每粒种子中的重量也显著降低。以上实验结果表明，GhKOR1基因对棉纤维的伸长及次生细胞壁纤维素的合成具有重要作用。
　　以上分析表明，GhKOR1基因对棉花种子及棉纤维的正常发育具有重要作用。本研究首次证明KOR基因对植物生殖器官发育的重要影响。

目录

声明

摘要

本文所用主要缩略词

第一章 纤维素生物合成研究进展

1．纤维素结构及特性

2．纤维素合酶及其复合体

3．纤维素合成相关基因及其突变体

3．1 初生细胞壁纤维素合酶突变体

3．2 次生细胞壁纤维素合酶突变体

3．3 直接参与纤维素合成的其它基因突变体

4．纤维素的沉积

5．纤维素合成的调节

6．纤维素生物合成模型

第二章 棉花胚珠及纤维发育研究进展

1．棉花胚珠发育研究

1．1 棉花胚胎发育

1．2 棉花胚乳发育

1．3 棉花种皮发育

1．4 胚珠发育的分子调节

2．棉纤维发育研究

2．1 棉纤维细胞的发育过程

2．2 棉纤维发育相关基因的克隆

3．棉花胚珠与棉纤维发育之间的相互关系

4．纤维素合成在棉花种子发育过程中的作用

第三章 植物内切-beta-1，4-葡聚糖酶研究进展

1．内切-beta-1，4-葡聚糖酶活性研究

2．内切-beta-1，4-葡聚糖酶分类

3．内切-beta-1，4-葡聚糖酶生理功能研究

4．膜联内切-beta-1，4-葡聚糖酶KORRIGAN在植物中研究进展

4．1 土壤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)

4．2 番茄(Lycopersicon esculentum)

4．3 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

4．4 油菜(Brassica napus)

4．5 水稻(Oryza sativa)

4．6 杨树(Populus)

5．膜联内切-beta-1，4-葡聚糖酶KORRIGAN在细胞中定位研究

6．膜联内切-beta-1，4-葡聚糖酶KORRIGAN与细胞壁生物合成的关系

本研究的目的和意义

第四章 棉花膜联内切-beta-1，4-葡聚糖酶基因GhKOR1在棉花胚珠发育过程中的功能研究

1．材料与方法

1．1 GhKOR1基因的克隆与载体的构建

1．2 植物材料与生长条件

1．3 转基因植株的PCR检测

1．4 序列分析

1．5 转基因植株RT-PCR表达分析

1．6 转基因植株种子生物量测定

1．7 转基因植株胚珠树脂超薄切片分析

1．8 纤维素含量测定

1．9 转基因植株幼苗生长势表型鉴定

2．结果与分析

2．1 GhKOR1氨基酸序列分析

2．2 GhKOR1基因的基因组结构分析

2．3 GhKOR1基因干扰载体片段与GhKOR2基因序列比对结果分析

2．4 GhKOR1基因及GhKOR2基因在棉花中的表达模式分析

2．5 GhKOR1及GhKOR2基因在转基因植株胚珠中的表达模式分析

2．6 GhKOR1转基因植株胚珠表型分析

2．7 GhKOR1基因对子代组织发育影响的分析

2．8 GhKOR1基因对种皮发育影响的分析

2．9 GhKOR1转基因植株幼苗生长势表型分析

3．讨论

3．1 纤维素含量分析过程中的几个问题

3．2 GhKOR1基因在棉花胚珠子代组织发育过程中的作用

3．3 GhKOR1基因在棉花种皮转运细胞发育过程中的作用

3．4 GhKOR1基因在幼苗生长发育过程中的作用

第五章 棉花膜联内切-beta-1，4-葡聚糖酶基因GhKOR1在棉花纤维发育过程中的功能研究

1．材料与方法

1．1 植物材料与生长条件

1．2 转基因植株的PCR检测

1．3 转基因植株棉纤维RT-PCR及qRT-PCR表达分析

1．4 转基因植株棉纤维表型分析

2．结果与分析

2．1 GhKOR1基因在棉纤维中的表达模式分析

2．2 GhKOR1基因在转基因棉纤维中的表达分析

2．3 GhKOR1转基因植株开花后20天棉纤维长度变异分析

2．4 GhKOR1转基因植株棉纤维纤维素含量变异分析

2．5 GhKOR1基因植株棉纤维在棉铃及种子中含量分析

3．讨论

3．1 GhKOR1基因是棉纤维发育过程中主要的膜联内切-beta-1，4-葡聚糖酶活性基因

3．2 GhKOR1基因在棉纤维发育中的作用

3．3 棉纤维长度的测量

全文结论

论文创新点

参考文献

附录

致谢

攻读博士学位期间发表及待发表论文