内切-1，4-β-葡聚糖酶基因转化棉花及转基因植株的再生研究

摘要

棉纤维是纺织工业的重要原料，在国民经济中占有重要地位。因此，从分子水平阐明棉纤维发育的机理，具有重要的理论价值和现实意义。 该研究利用一个与拟南芥KOKRIGAⅣ基因(编码跨膜内切-1，4-β-葡聚糖酶)高度同源的棉花基因GhCEL(GenBank accession number：AY574906)成功地构建了该基因的RNAi表达载体和正义表达载体，将上述两个表达载体通过农杆菌介导法分别转入棉花，试图阐明该基因的过量表达和抑制表达对受体棉花植株及其棉纤维品质的作用，为今后进一步将该基因应用于植物的遗传改良奠定基础。主要结果如下： 1.棉花遗传转化体系的优化 研究结果表明，在以下胚轴作为受体的棉花遗传转化体系中，转化初期将愈伤诱导培养基中的KNO<,3>加倍，有利于愈伤的起动和增殖；潮霉素筛选的起始浓度为5mg/L最佳，而在愈伤生长和增殖阶段，潮霉素浓度可增加到10mg/L，然后经过2～3次继代即可去掉潮霉素，有利于愈伤的生长和分化。 2.目的基因的转化及胚性愈伤系的获得 利用根癌农杆菌介导转化法将构建的GhCEL基因的RNAi表达载体和正义表达载体分别转入棉花受体W<,0>中，在筛选培养基中当抗性愈伤长到直径为0.5cm左右时将其从外植体上剥离下来，转入含10mg/L潮霉素的培养基上继续培养，待生长至直径为1.0cm左右即转入胚性愈伤诱导培养基中，总共获得了62个分化的抗性愈伤系。经过GUS检测和PCR验证，其中有阳性愈伤系42个，平均阳性率为67.7％。 3.转化植株的分子检测 总共获得转基因再生植株300多株，用Hpt基因特异引物对其中的239株进行了PCR检测，初步确定190株为阳性，阳性率为79.5％。110株转正义基因的再生植株除了用Hpt基因特异引物扩增外，还设计了启动子.基因特异引物进行扩增。结果表明，两种引物扩增得到的阳性率有较大差异，用启动子.基因特异引物扩增的阳性率为52.7％，远远低于Hpt基因特异引物扩增得到的阳性率79.1％。只有两次PCR扩增结果都为阳性的植株才被初步认为是转基因植株。以Hpt基因片段作为探针，随机取转RNAi基因的T<,0>代7株PCR阳性植株做Southem杂交。结果证明Hpt基因已经整合到植物基因组中。 4.转基因植株的嫁接和移栽 总共嫁接了50株转RNAi．基因的植株，成活35株，成活率可达70％以上。而移栽的20株再生苗最后成活的只有4株，成活率不到20％。转RNAi基因T<,0>代植株与受体W<,0>的再生植株相比，株型除了个别的变得比较紧凑外，大部分没有太大的变化；但是T<,0>代的纤维都比对照的短。转基因棉花的株型及其纤维品质变化原因还有待进一步的研究和分析。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

第一部分文献综述

引 言

1 RNA干涉的机制及其在植物基因工程中的应用

1.1 RNAi的作用机制

1.2 RNA介导的基因沉默在植物基因工程中的应用

2棉花遗传转化技术研究

2.1农杆菌介导法

2.2基因枪法

2.3农杆菌法和基因枪法结合的转化方法(简称农杆枪法)

2.4花粉管通道法

2.5选择标记基因

2.6报告基因

3棉花遗传转化的主要成就

3.1转基因抗虫棉

3.2转基因抗除草剂棉

3.3转基因抗病棉

3.4转基因抗盐棉

3.5转基因杂种棉

3.6转基因抗逆棉

4棉花纤维品质的转基因育种现状

4.1棉纤维发育基因的克隆

4.2外源纤维基因的导入与棉纤维品质的改良

5内切-1，4-β-葡聚糖酶

5.1概述

5.2 EGases在植物纤维素生物合成中的作用

6本研究的目的、意义

第二部分研究报告

引言

1材料与方法

1.1实验材料

1.2方法

2结果与分析

2.1植物表达载体的农杆菌转化

2.2农杆菌介导的棉花遗传转化

2.3转基因植株的分子检测

2.4转RNAi基因T0代植株和纤维的表现

3讨论

3.1农杆菌介导的棉花遗传转化

3.2转基因植株的分子检测

3.3下一步工作设想

全文总结

参考文献

致谢

作者简介