生防木霉(Trichoderma guizhouense NJAU4742)重寄生分子机理研究Ⅰ——中性金属肽酶NMP1和活性氧的功能分析

摘要

重寄生是指一种真菌捕食或者寄生另外一种真菌，获取营养，满足自身的生长繁殖;当被捕食的或被寄生的是植物病原真菌，可以抑制病原真菌的生长繁殖，达到生物防治植物真菌病害的效果。由尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种（Fusariumoxysporum f.sp.cubense4，Foc4）侵染引起的香蕉枯萎病（巴拿马病）是目前香蕉产业发展最为严重的限制因子。目前防控枯萎病的方法主要有化学杀菌剂和生物杀菌剂，而化学杀菌剂的大量使用会引发环境和食品质量问题，因此研究利用以生物杀菌剂为主导的综合防控具有重要意义。研究和应用最广泛的真菌杀菌剂是在根际有较强竞争能力的木霉（Trichoderma spp.），因为其能重寄生植物病原真菌，减轻真菌引起的病害;定殖植物根际，活化养分，促进植物生长，并能诱导植物提高对多种植物病原真菌的系统抗性(Induced Systemic Resistance，ISR)，提高经济作物产量。目前生产应用中木霉菌剂主要有哈茨木霉（Trichoderma harzianum）、绿木霉（Trichoderma virens）和深绿木霉（Trichoderma atroviride）。但是由于木霉分子生物学研究起步晚，技术难度大，限制了木霉重寄生机理的研究进展。
　　本研究筛选一株具有强重寄生能力的木霉NJAU4742，分析确定NJAU4742其在木霉菌中进化分类;通过优化农杆菌介导转化方法，荧光标记NJAU4742，跟踪其在土壤颗粒、肥料颗粒和植物根际的定殖;再通过构建T-DNA随机插入突变子库，筛选弱寄生能力的突变子，分析T-DNA在NJAU4742基因组的插入位点，确定插入位点基因的功能;最后，比较NJAU4742菌丝分泌的代谢组分的抑菌能力差异，结合相关功能基因的敲除与过量表达，确定NJAU4742重寄生植物病原真菌的重要因子。
　　主要研究结果如下:
　　1.筛选一株对植物病原真菌Foc4、灰葡萄孢菌、交链格孢菌、核盘菌、水稻恶苗病菌、立枯丝核菌和齐整小核菌有强寄生能力的NJAU4742，通过扫描电子显微镜（Scanning Electronic Microscopy, SEM）观察到NJAU4742菌丝能够缠绕或者紧贴Foc4菌丝生长。Trypan Blue染色确定NJAU4742的代谢产物在NJAU4742菌丝缠绕Foc4菌丝过程中破坏Foc4的菌丝结构。NJAU4742水溶性代谢产物能够抑制灰葡萄孢菌、交链格孢菌、核盘菌、立枯丝核菌和齐整小核菌的生长，但不能明显抑制Foc4菌丝延伸;GC-MS分析NJAU4742挥发性气体的成分，在封闭环境中，3-辛酮、萘、1-甲基萘和1-辛烯-3-酮均能抑制Foc4菌丝生长;测定NJAU4742的胞外水解酶的特征，确定灭活Foc4菌体能够诱导NJAU4742分泌几丁质酶、类胰蛋白酶和类糜蛋白酶。根据NJAU4742基因cal1、 chi18-5和tef1的序列，贝叶斯进化分析，确定NJAU4742在木霉属中分类位置，区别于模式菌株Trichoderma harzianum CBS226.95(CBS)的分支。比较NJAU4742和CBS的重寄生病原真菌的特异性和水溶性代谢产物的抑菌活性，避光条件下，CBS菌丝重寄生Foc4的能力较弱，其菌丝无法覆盖Foc4菌落，其水溶代谢产物抑制活力也弱。结合Biolog代谢谱分析，鉴定NJAU4742属于Trichoderma guizhouense。
　　2.优化农杆菌介导转化NJAU4742分生孢子的方法，确立最佳的转化共培养温度、农杆菌与分生孢子共培养的载体和农杆菌类型，该方法被证实适用转化T.aggressivum CPK375、T.pleuroticola CPK2104、T.pleurotum CPK2094和Foc4，并有较高的转化效率。荧光标记NJAU4742，跟踪其在土壤和有机肥料颗粒表面定殖，利用突变子潮霉素B抗性，平板计数;盆栽实验证明，NJAU4742能够促进香蕉植株生长，提高抗病能力，并观察到NJAU4742成功定殖植物根际。
　　3.通过农杆菌介导转化，T-DNA随机插入NJAU4742，构建突变子库，纯化得到80个突变子，筛选出一株特异突变子，其菌丝不能覆盖Foc4、灰葡萄孢菌和链格孢菌，水溶性代谢产物的抗真菌活性降低。HiTAIL-PCR确定T-DNA插入NJAU4742基因组中一个金属肽酶基因（编码MEROPS家族M35蛋白酶）的终止子，金属肽酶命名为nmp1。突变子回复突变，恢复野生型具有的重寄生能力。毕赤酵母表达NMP1，大小约18.7 kDa;分析蛋白结构，NMP1含有独特HEXXH motif,结合2个锌离子，另外GTXDXXYG motif结合第三个锌离子。纯化的NMP1不能抑制病原真菌的生长，但对峙平板中，NMP1能部分恢复突变子的重寄生齐整小核菌的能力，增强野生型NJAU4742重寄生能力。通过实时定量PCR，灭活Foc4菌丝，对峙中感应和接触病原真菌菌丝能够诱导NJAU4742 nmp1的表达。
　　4.收集NJAU4742重寄生Foc4菌丝过程中菌丝表面形成的黄色液体，GC-MS分析其中化合物，鉴定为硬脂酸和棕榈酸。硬脂酸和棕榈酸是细胞膜组成成分，说明重寄生过程中，有菌丝被消化。分析液滴酶活，有较高的几丁质酶和蛋白酶，同时能检测出H2O2。比较NJAU4742粗酶液（Foc4菌丝诱导）、正丁醇提取物（溶解NJAU4742次级代谢产物）和H2O2对Foc4菌丝的抑制效果，确定H2O2有抑制活力。染色研究NJAU4742菌落对峙Foc4菌落过程中活性氧的变化，NJAU4742菌丝接触Foc4后，H2O2集聚。荧光定量PCR分析对峙Foc4过程中NJAU4742的Fe-sod, Mn-sod和Cu/Zn-sod（编码Superoxide Dismutase，SOD，功能是将O2·-氧化成H2O2）表达量提高。碘化丙啶染色表明10 mM H2O2处理Foc4萌发的孢子和菌丝，破坏细胞膜结构;PDA平板上，5mMH2O2能够部分抑制立枯丝核菌和齐整小核菌的生长，改变核盘菌、交链格孢菌和Foc4菌落形态。
　　构建敲除nox1（编码NADPH oxidase1，Nox1）载体，PEG-CaCl2介导转化原生质体，得到410个突变子，通过PCR筛选出一株阳性转化子。转化子△nox1避光下失去野生型强寄生核盘菌、Foc4和齐整小菌核能力，同时伤害应激反应减弱。
　　构建过量表达nox1载体，转化突变子△nox1，恢复野生型NJAU4742避光条件下强寄生核盘菌、Foc4和齐整小菌核的能力;转化野生型NJAU4742，定量PCR确定nox1转录水平，转化子较野生NJAU4742表现出更强的寄生能力。光照下，突变子能够重寄生核盘菌、齐整小菌核菌落、Foc4和灰霉病菌。
　　结论:菌株NJAU4742有较强的重寄生多种植物病原真菌能力;适应能力强，能在土壤颗粒表面定殖;能利用有机肥料再次发酵，提高NJAU4742数量级。分析NJAU4742次级代谢产物中不同组分，确定H2O2是NJAU4742菌丝破坏Foc4菌丝的最重要的物质;Foc4菌丝体能够诱导分泌水解酶更，裂解菌丝满足NJAU4742菌丝的生长。

目录

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声明

论文说明

摘要

缩略语及专有词汇检索表

第一章 文献综述

1 土传病害真菌及防控

1．1 土传病害真菌的种类与表现

1．2 土传病害的成因

1．3 土传病害防治

2．生防木霉国内外研究概况

2．1 生防木霉菌的生物学特征和应用现状

2．2 生防木霉菌防治病害机制

2．3 生防木霉促生机制研究现状

2．4 真菌蛋白酶的研究进展和功能

3 丝状真菌的研究方法

3．1 正向遗传学方法

3．2 反向遗传学方法

3．3 基因打靶

4 研究目的、意义及技术路线

4．1 研究的目的和意义

4．2 研究技术路线图

第二章 Trichoderma guizhouense NJAU 4742鉴定与重寄生特征分析

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 筛选和纯化强寄生能力的木霉

2．2 染色分析NJAU 4742和Foc4的菌丝完整性

2．3 NJAU 4742挥发性气体抑制Foc4菌丝生长

2．4 NJAU 4742挥发性气体成分与抑菌效果

2．5 Foc4菌丝体诱导NJAU 4742分泌胞外水解酶

2．6 实时荧光定量PCR分析chil8-5、nag1和gluc78表达

2．7 贝叶斯进化分析NJAU 4742

2．8 比较NJAU 4742和CBS重寄生及代谢特征

2．9 光敏感性分析

3 讨论

4 小结

第三章 Trichoderma guizhouense NJAU 4742荧光蛋白标记及其定殖研究

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 分析NAJU4742对潮霉素敏感性

2．2 根癌农杆菌介导的NJAU 4742遗传转化体系的建立与优化

2．3 转化子的PCR和荧光检测

2．4 AMT体系在其他真菌中的推广应用

2．5 标记菌株NJAU 4741遗传稳定性、重寄生和Biolog分析

2．6 标记菌株NJAU474l在土壤和肥料中的定殖研究

2．7 标记菌株NJAU4741对土壤酶活的影响

2．8 标记菌株NJAU 4741定殖植物根际与促生研究

3 讨论

4 小结

第四章 Trichoderma guizhouense NJAU 4742重寄生突变菌株的筛选和分析

1．材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 比较野生型NJAU 4742和突变子NJAU 4743对镰刀菌的拮抗能力

2．2 突变子NJAU 4743丧失强拮抗多种植物病原真菌的活性

2．3 野生型NJAU 4742和突变子NJAU 4743菌丝代谢谱的比较

2．4 NJAU 4742和突变子NJAU 4743水溶性代谢产物的抑茵效果

2．5 T-DNA插入位点侧翼序列的克隆与分析

2．6 反转录PCR确定T-DNA插入位点的沉默基因

2．7 反向遗传学回补突变菌株

2．8 验证回复突变子NJAU 5307和NJAU 5308拮抗活性

2．9 测定NJAU4742不同生长阶段的nmpl表达

3 讨论

4 小结

第五章 Trichoderma guizhouense NJAU 4742中性金属肽酶NMP1异源表达与功能分析

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 NMP1序列比对分析

2．2 蛋白预测与结构分析

2．3 NMP1进化分析

2．4 基因nmp1酵母表达载体构建及转化

2．5 Western Blot分析酵母转化子发酵液

2．6 NMP1蛋白纯化与测序

2．7 粗酶液酶活

2．8 NMP1对病原真菌的拮抗能力测定与分析

2．9 测定对峙多种病原真菌中基因nmp1表达

3 讨论

4 小结

第六章 功能性分析活性氧在Trichoderma guizhouenseNJAU 4742重寄生过程的作用

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 分析菌丝表面黄色分泌物

2．2 间接分析对峙平板不同位置菌丝分泌的酶活和H2O2

2．3 原位检测NJAU4742对峙Foc4的平板上H2O2和O2·-

2．4 分析正丁醇提取液、粗酶液和H2O2对Foc4菌丝影响

2．5 植物病原真菌和NJAU 4742菌丝对H2O2敏感分析

2．6 NJAU 4742活性氧相关基因显著上调

2．7 基因nox1的敲除

2．8 NJAU 4742和△nox1突变子的菌丝形态差异

2．9 △nox1基因互补子及突变株的筛选及验证

2．10 过量表达nox1质粒转化与突变株的筛选

2．11 比较过量表达突变子和△nox1的重寄生能力

3 讨论

4 小结

参考文献

全文结论及展望

一、全文结论

二、展望

创新点

附录

博士期间已(待)发表的论文

会议摘要

致谢