重组火鸡疱疹病毒rHVT--VP2实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

摘要

火鸡疱疹病毒(HVT)是普通存在于家养火鸡体内的一种无致病性的α疱疹病毒。在遗传学和血清学上，HVT与马立克病病毒(Marek's disease virus，MDV)具有相关性，且HVT对鸡不致病，HVT Fc126株被广泛用于预防鸡的马立克病(Marek's disease，MDV)。此外，HVT基因组大，有许多非必需基因和非编码区，能够容纳大片段外源基因序列的插入;并且可以进行胚内接种或1日龄早期接种免疫;不但能避免母源抗体的干扰而且启动免疫快。因此，HVT是一种较理想的鸡用活疫苗病毒载体。本研究应用建立的rHVT-VP2实时荧光定量PCR，旨在探究rHVT-VP2在体内外的复制情况、鸡体内各组织器官病毒的分布及病毒复制效率与抗体水平之间的关系，为新型活载体疫苗的研制、疫苗免疫效果的评价及毒株的筛选奠定基础。 本文根据Genbank已发表的火鸡疱疹病毒(HVT)特异性SORF1基因序列，设计并合成能特异性扩增出160bp核酸片段的引物及与其匹配的TaqMan探针，通过PCR扩增得到目的基因序列，随后将该特异性片段克隆至T-VectorpMD19(Simple)，并转化至大肠杆菌DH5α中，之后再通过阳性重组质粒筛选、鉴定及核苷酸序列测定等方法，成功获得阳性重组质粒。将构建好的阳性质粒纯化后作为标准品，通过10倍系列梯度稀释法构建标准曲线。同时，根据正交试验分别对引物和探针的浓度进行了优化，确立了FQ-PCR的最佳反应体系和反应条件，最终建立了rHVT的FQ-PCR检测方法。研究表明该方法特异性强，对传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊病毒.、马立克氏病毒、新城疫病毒及SPF鸡胚CEF的DNA或cDNA作为模板，进行荧光定量检测，均未出现阳性信号;对保存不同时间的重组质粒(1d，30d)的稳定性和重复性进行了定量检测，研究发现组间组内变异系数为0.11％～2.13％，表明本实验构建的方法具有较好的重复性和稳定性;将构建的T-SORF1重组质粒用双蒸水做10倍梯度稀释，分别进行常规PCR和TaqMan探针FQ-PCR检测，研究表明FQ-PCR检测的灵敏度是常规PCR的10倍。 其次，应用优化的荧光定量PCR方法对不同rHVT-VP2重组毒及HVT FC126亲本毒在CEF和鸡羽囊中的复制效率进行了定量检测，研究发现rHVT-VP2重组毒在体内外复制效率均低于HVT FC126亲本毒株。在免疫鸡不同组织样品中，羽囊中病毒含量最高，并对羽囊中病毒的复制情况进行定量检测，研究发现雏鸡在免疫后第4～5周羽囊中病毒的拷贝量达到峰值;同时结合毒株的免疫效果(AGP抗体效价)，对病毒的复制效率与VP2蛋白诱导产生AGP抗体效价之间的关系进行了初步探讨，研究表明病毒的复制效率与VP2蛋白诱导产生AGP抗体效价具有一定的相关性。

目录

声明

摘要

缩略语及符号

绪论

第一章文献综述

1 马立克氏病的概况

1．1 马立克氏病毒的分子生物学特征

1．2马立克氏病毒的致病机理

1．3马立克氏病的诊断技术

1．4马立克氏病疫苗的研究进展

2传染性法氏囊病概况

2．1传染性法氏囊病毒的生物学特性

2．2传染性法氏囊病毒的致病机理

2．3传染性法氏囊病的诊断技术

2．4传染性法氏囊病疫苗的发展趋势

3火鸡疱疹病毒载体的研究进展

3．1 火鸡疱疹病毒载体疫苗的优势

3．2火鸡疱疹病毒载体构建基础

3．3 HVT活载体疫苗的研究进展

第二章重组火鸡疱疹病毒rHVT-VP2实时荧光定量PCR检测方法的建立

1材料与方法

1．1材料

1．2方法

2结果与分析

2．1 rHVT-VP2全基因组的获得

2．2标准品阳性质粒的鉴定

2．3重组质粒PCR退火温度的的确定

2．4 TaqMan探针FQ-PCR反应体系的优化

2．5重组质粒拷贝数的计算

2．7 TaqMan探针FQ-PCR检测方法的敏感性

2．9 TaqMan探针FQ-PCR检测方法的重复性及稳定性

2．10 rHVT-VP2在家禽体内分布的定量检测

3讨论

3．1 TaqMan探针实时荧光定量PCR的建立

3．2 rHVT-VP2在家禽组织及器官的分布

参考文献

第三章rHVT-VP2体内外生长特性及病毒复制效率与抗体反应水平的关系

1材料与方法

1．1 材料

1．2方法

2结果

2．1 rHVT-VP2在CEF上复制的定量检测

2．2 rHVT-VP2在羽囊中复制的定量检测

2．3 rHVT-VP2重组毒免疫雏鸡琼扩效价的检测

2．4病毒复制效率与抗体水平的关系

3讨论

3．1 rHVT-VP2重组毒体外复制特性的研究

3．2病毒的复制效率与VP2血清抗体反应水平的关系

参考文献

全文总结

附录

致谢