锦鲤疱疹病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

摘要

研究建立并完善了Taqman 实时荧光定量PCR检测锦鲤疱疹病毒(KHV)的方法.首先通过选取KHV病毒TK基因的保守序列(GenBank AB182940),利用PRIMER EXPRESS 2.0设计引物和探针.其中Taqman探针的5'端标记FAM,3'端标记TAMRA.然后利用梯度稀释的阳性样品克隆质粒进行定量PCR反应,制作标准曲线,得到病毒拷贝数与Ct值的关系为:Ct=-3.45 lgX+42.73(相关系数R2=0.989).通过试验检测得到实时荧光定量PCR对KHV的灵敏度为32个病毒核酸拷贝数,同时,设计的引物和探针对于鱼类细胞系和其它鱼类病毒没有扩增反应,表现出较好的特异性.实验结果表明,实时荧光定量PCR检测KHV的方法,具有特异性好、灵敏度高的特点,可以缩短检测时间,提高检测速度,非常适合口岸进出口检验检疫的要求.