耐热木聚糖酶（XYNB）的分离纯化与性质研究

摘要

木聚糖是植物半纤维素的重要组成部分，在自然界中是继纤维素之后含量第二丰富的再生物质资源。木聚糖结构复杂，它的完全降解需要多种水解酶的共同作用。内切-β-1,4-木聚糖酶（1,4-β-D-木聚糖水解酶，EC3.2.1.8）以内切的方式作用于木聚糖的主链，产生不同链长的寡糖及少量的木糖，是木聚糖降解酶系中关键的酶。木聚糖酶的耐高温和热稳定性是工业化应用的理想特性，在生物转化、制浆造纸，食品饲料等工业中存在很大的应用潜力。 本文综述了木聚糖酶的分离纯化技术以及性质和结构研究进展，研究了重组大肠杆菌1020产生的耐热木聚糖酶（XYNB）的纯化方法与性质。 采用不同的破碎方法，对表达的木聚糖酶在细胞中的分布进行分析，确定了表达的耐热木聚糖酶XYNB主要分布中可溶性细胞质中。纯化前对表达的酶进行细胞定位是本论文的一个特色。 XYNB是胞内酶，采用反复冻融和超声波联合的方法破碎，发现对湿菌泥反复冻融三次后，酶的释放量最大；50 mL 20％的菌悬液，采用500 W，间歇时间10 s，超声波破碎15 min后，酶的释放量最大。利用热变性除去杂蛋白，选择变性温度70℃，时间30 min，回收率可达到69.4％，纯化倍数4.9。结合Ni-NTA亲和层析，采用梯度洗脱方法，一步得到电泳纯XYNB，回收率29.4％，纯化倍数13.4。采用热变性和一步亲和层析分离得到电泳纯的耐热木聚糖酶XYNB，简化了分离纯化步骤，是本论文的一个特色。 酶学性质研究表明XYNB的最适pH在6.5左右，在pH 6.0-10.0能保持最高活力的60％以上，在pH值低于6.0和高于10.0时，活力显著下降。在50-100℃范围内，酶催化活力随着温度的升高不断上升，酶在80-100℃范围内表现出50％以上的酶活力。在pH8.0，70℃，保温6 h后，酶活力变化不大；100℃保温1.5 h后，残余50％的酶活力。1mmol/L Hg2+显著影响酶活力，其它金属阳离子和EDTA对酶活的影响不大。XYNB对Oat spelt xylan 酶促反应的Km为0.23 mg/mL，最大反应速度Vmax为0.36 μmol/(min﹒mL)。 采用生物信息学手段分析XYNB的序列和结构，发现XYNB属于F/10族，与Thermotoga sp. Strain FjSS3-B.1的xyn A有85％一致性，与Thermotoga neapolitana的xylanase B有83％一致性。XYNB序列中Glu647(E727)，Glu753(E862)，His598(H656)，Trp602(W660)是保守的，对酶表现活力有重要影响。XYNB前19个氨基酸构成酶的信号肽。整个肽链折叠成β/α桶形，这与大多数F/10族的结构相似。分析XYNB的氨基酸组成与结构，并与其它木聚糖酶比较，发现XYNB中不稳定氨基酸（Ser, Thr, Cys, Asn, Gln）含量低，Pro的含量高于嗜温木聚糖酶，结构上含有较多的离子对，以及低的溶剂可及疏水表面积和高的带电残基溶剂可及表面积，这些因素稳定了酶的构象，增强了酶的热稳定性。 采用化学修饰的方法讨论酶的必需氨基酸，进一步证实了Trp, Glu是酶表现活力的必需氨基酸，Trp对底物和酶的结合起关键作用，Glu是酶表现活力的重要氨基酸。对His, Cys, Ser的修饰后，酶活力变化不明显，这些氨基酸对酶的构象或活性影响不大。WRK修饰的XYNB热稳定性下降，进一步证明了离子对对酶热稳定性的重要作用。在序列和结构分析的基础上对保守氨基酸进行化学修饰，提高了化学修饰的针对性，同时从序列和结构的角度对化学修饰的结果进行合理的解释，这是本文的一个创新点。