嗜热栖热菌木糖异构酶结构与功能关系及改造研究

摘要

近年来，随着对可再生资源的利用及发展循环经济的迫切需要，利用木糖异构酶构建发酵半纤维素水解产物木糖生产乙醇的重组菌成为研究热点。由于嗜热木糖异构酶在酿酒酵母中表达出活性，并参与了酿酒酵母木糖代谢途径的构建，故而深入了解其独特的结构机理并通过酶分子改造提高其活性，对构建新型高效利用木糖生产乙醇的重组酿酒酵母菌具有重要的理论及应用意义。
　　 本论文对木糖异构酶的基本性质、序列及结构特点、催化机理、热稳定性机理以及蛋白质理性设计的方法等进行了较全面的论述。针对嗜热木糖异构酶结构的复杂性及其在低温下活性极低等问题，以嗜热栖热菌木糖异构酶(Thermus thermophilusxylose isomerase，TthⅪ)为研究对象，运用计算生物学及分子酶学等方法，较系统的研究了该酶结构与功能的关系。
　　 运用基因工程技术，从T.thermophilus中获得了具有N91D突变的嗜热木糖异构酶(TthⅪ-N91D)基因，在E.coli BL21(DE3)中进行高效表达并分离纯化，对TthⅪ-N91D酶学性质进行了研究。结果表明，TthⅪ-N91D最适温度为80℃，最适pH为8.0，80℃下半衰期为225 min。在60℃，pH7.5下该酶的Km为15.20 mmol·L-1，rmax为69.54μmol·min-1，kcat为50.62 s-1，kcat/Km为3.33 L·s-1·mmol-1。TthⅪ-N91D的底物特异性实验表明该酶可专一催化木糖。根据TthⅪ-N91D专一催化底物木糖的特性，建立了一种利用该酶检测溶液中木糖含量的新方法。该方法所需TthⅪ-N91D1.5U，山梨醇脱氢酶0.08 U，辅酶NADH终浓度为0.25 mmol·L-1，检测过程仅需20 min，检测木糖的线性范围在2.5-12.5 mmol·L-1之间。检测方法的标准偏差为0.652％-3.590％，回收率为97.4％-105.8％，与HPLC比较具有良好的线性相关性。试验结果表明该方法在多种糖混合溶液中可以特异性的检测出木糖的浓度，回收率为93.1％-102.2％。该方法简便，耗时短，可以同时检测多个样品，结果较为稳定可靠。该方法已经成功应用于本实验室酿酒酵母发酵过程中木糖消耗的检测。
　　 为了更好地阐明TthⅪ-N91D酶学性质的结构机理，首先运用分子对接软件，构建了TthⅪ与底物木糖的复合物模型。对复合物模型分析显示，残基E180、E216、D244和D286等羧基氧原子与Mg1之间的距离分别为0.204 nm、0.207 nm、0.202 nm和0.206nm，处于形成配位键的范围之内。残基H53、E180和E216等和D-木糖之间形成氢键稳定了底物在活性中心的构象。在上述模型基础上运用WHAT IF5.0软件进行了N91D突变酶的同源建模，突变前后活性中心的构象比较分析表明N91D突变导致残基H53原子NE2与底物木糖O5原子之间的距离比突变前下降了0.083 nm，有利于底物开环过程中H原子的传递；残基T89 OG1与木糖C5之间的距离由突变前的0.519 nm下降为突变后的0.386 nm，不利于容纳与稳定葡萄糖O6有关的水分子及体积更大的葡萄糖底物，可能是其易于结合底物木糖及催化专一性增加的主要原因。其次，为了更好地了解嗜热木糖异构酶在高温下活性增加的结构动态行为，运用分子动力学模拟的方法探讨了不同温度对TthⅪ复合物结构柔性的影响。模拟结果显示，在300 K和360 K，残基片段60-69、142-148、169-172和334-340的B-因子都较高显示出较大的柔性。与300 K相比，在360KB-因子上升0.06 nm的残基主要分为两组：一组涵盖了残基55-80组成的helix-loop-helix区域中70％的残基，另一组位于TthⅪ亚基界面上。对不同温度下TthⅪ四聚体亚基界面相互作用进行了分析比较，发现在360 K亚基界面比300 K分别减少了8个氢键和5个离子对。高温360 K下特定残基柔性增加及亚基界面相互作用的下降，可能是导致TthⅪ具有较高催化活性的关键因素。这些分子模拟结果可以为理性设计改善TthⅪ-N91D低温下活性提供理论指导。
　　 基于嗜热木糖异构酶与其相应常温酶保守残基的差异，结合对亚基界面保守位点处相互作用分析的结果，首次提出定点突变嗜热酶的保守残基降低亚基间相互作用以改善TthⅪ低温下活性的策略。研究发现，嗜热木糖异构酶中的保守残基R60、R252、P108、W154、F163、S197、D236、D336、P360、K355、M250、E262、F301及V385都位于亚基界面上，在常温酶中被残基F、K、R、L、L、H、W、E、D、A、G、G、S及A替代。综合考虑嗜热木糖异构酶的结构特点，并构建突变酶的同源模型细致分析突变前后对亚基间相互作用的影响，有针对性地选取嗜热木糖异构酶亚基界面保守残基，并设计V144A、D375G、K355A、R60F/V144A以及D375G/V385A突变，以期通过降低亚基间的氢键、疏水作用和离子对作用来改善嗜热酶低温下的活性。
　　 运用基因工程的方法，在大肠杆菌中高效表达突变酶并进行分离纯化，对突变酶与TthⅪ-N91D的最适pH、最适温度、热稳定性以及反应动力学常数进行了比较与分析。结果表明，所设计的五种突变酶中有四种在低温下活性明显增加。在pH7.0，50℃时突变酶D375G/V385A、D375G、K355A和V144A的活性分别是TthⅪ-N91D的1.29、1.76、2.59和3.25倍。在pH5.0-9.0突变酶D375G、K355A和V144A的活性都明显高于TthⅪ-N91D。对突变酶及TthⅪ-N91D的热稳定性研究表明，除突变酶K355A以外四种突变酶D375G、D375G/V385A、V144A及R60F/V144A的热稳定性都比TthⅪ-N91D有所下降。突变酶D375G/V385A的半衰期约为120 min，突变酶D375G以及R60F/V144A的半衰期约为240 min。反应动力学参数研究表明，在60℃，pH7.5时，突变酶K355A、D375G及V144A的催化效率都显著增加，分别约为TthⅪ-N91D的2.93、1.75和1.77倍。实验结果证明通过对TthⅪ亚基界面保守残基的定点突变来降低亚基间相互作用能够有效的改善其冷适应性。该方法对其它嗜热菌中木糖异构酶的冷适应性改造具有积极的借鉴意义。
　　 从理论上初步探讨了突变酶热稳定性和催化活性变化的机理。D375G突变破坏了位于亚基界面上的D375-E372-R258*离子对网络可能是突变酶D375G和D375G/V385A热稳定性显著下降的主要原因。对残基突变所引起的构象熵进行了计算，推测突变酶K355A构象熵的显著下降可能是其保持高热稳定性的重要因素。另外，通过对R60F/V144A同源模型的活性中心及实验结果分析，证明了TthⅪ亚基界面上的特殊离子对R60-D27*不仅对于维持TthⅪ高热稳定性起到一定的作用，而且更重要的是通过该离子对稳定另一亚基的长loop(残基18-34)结构，确保F25*在活性中心的正确构象。