嗜热细菌木糖异构酶的分子改造及纤维堆囊菌xylA的克隆与表达

摘要

燃料乙醇是最有发展前景的新型可再生能源，其生产和应用因在经济发展和战略安全上的重大意义，越来越受到各国政府的重视。自然界中含有丰富的植物纤维资源，而目前只有3-4％的植物纤维资源被有效地利用。木糖是木质纤维素水解物中含量仅次于葡萄糖的一种单糖，实现木糖转化乙醇是纤维素乙醇生产需要解决的难题之一。 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是传统上食品及化工工业的最佳生产菌株，在工业生产中有上百年的酒类发酵应用历史，具有乙醇产量高、抗逆性强等许多优良特性，是乙醇工业生产的首选菌株。然而酿酒酵母菌缺乏转化木糖生成木酮糖的酶而不能利用木糖，但能利用木糖的异构体形式——木酮糖。 根据代谢途径工程理论，采用代谢流扩增和底物谱拓展的所谓“加法战略”，重组表达木糖向木酮糖转化所需的相关酶基因，是在酿酒酵母中建立木糖代谢途径的有效措施。木糖异构酶(xylose isomerase XI)能直接转化木糖生成木酮糖，不需要任何辅因子，被认为是在酿酒酵母建立木糖代谢的首选途径。但迄今为止只有三种来源的木糖异构酶基因xylA在酿酒酵母中得到活性表达，由于它们在酵母发酵温度30℃条件下的酶活性相对比较低，还不能适应乙醇发酵的要求。 本论文主要包括两个方面，一方面对已经在酿酒酵母中得到活性表达的嗜热细菌Thermus thermophilus木糖异构酶XI进行分子改造，以提高其在酵母发酵温度下的酶活性：另一方面，克隆中温型嗜纤维素粘细菌纤维堆囊菌Sorangiumcellulosum的木糖异构酶基因xylA并在酿酒酵母中得到活性表达。 在相关文献研究结果的基础上，对一系列木糖异构酶氨基酸序列进行比对，同时分析了T thermophilus木糖异构酶的三维结构；选择两个氨基酸残基位点Pro137和Asp247突变成Gly。通过定点突变获得三个突变体XI137(Pro137Gly)、XI2417(Asp247Gly)、XI137247(Pro137Gly，Asp247Gly)，并构建表达载体XM204-XI137、XM204-X12417和XM204-XI137247，转化实验室酿酒酵母H158，得到重组菌株H158-XI137、H158-X1247和H158-XI137247，然后对重组菌株进行酶活性分析。结果显示：相对于野生型的XI，突变体XIl37、X1247和XI137247中温条件下的酶活性有所提高，特别30℃的酶活比原初XI提高一倍：最适pH范围有很大的拓展，在pH6.0-9.0之间都能表现出很高的酶活性；但是，突变体X1137和X1137247的热稳定性有很大的降低。这些表明，嗜热细菌木糖异构酶的137位Pro对其热稳定性和最适pH起到很大的作用；而247位的Asp的作用不明显。为Pro在蛋白质结构中发挥的作用提供了又一证据，也获得了中温下酶活性稍高的突变体，从理论和应用两方面取得了一定的进展。在对嗜热细菌XI分子改造的同时，克隆得到纤维堆囊菌(S.cellulosum)157-2的木糖异构酶基因xylA并在酿酒酵母中得到活性表达。通过对系列木糖异构酶核苷酸和蛋白质序列分析得到木糖异构酶基因的同源序列，设计简并引物扩增得到分子探针片断，利用此分子探针对Bamhi和SalI完全酶切的纤维堆囊菌157-2基因组DNA进行杂交，并获得特异性杂交片段B1800、B5500、S2000和S2500：然后经过片段自连，利用反向PCR扩增得到S2500的反向片段，测序并进行拼接和生物信息学分析，设计引物克隆得到长1332bp，编码433个氨基酸的开放阅读框，确认为纤维堆囊菌157-2的木糖异构酶基因。然后，构建表达载体XM204-X1157-2并且在酿酒酵母中得到活性表达。纤维堆囊菌157-2的木糖异构酶最适反应温度为30℃，最适pH为6.0，偏好金属离子Mn<'2+>；比酶酶活达到0.3U／mg蛋白。为建立酿酒酵母新的XI木糖代谢途径打下了坚实的基础。

目录

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摘要

本文缩写词表

第一章前言

第二章嗜热细菌(T.thermophilus)木糖异构酶的分子改造

第三章纤维堆囊菌157-2木糖异构酶基因的克隆与表达

全文总结

参考文献

致谢