稳定表达不同动物犬瘟热病毒受体SLAM的Vero细胞系的建立

摘要

犬瘟热(Canine distemper，CD) 是由犬瘟热病毒（Canine distemper virus，CDV）病毒引起的一种高度接触性传染病。该病是养犬业、毛皮动物养殖业危害最大的传染病病之一，可引起大批犬、貂、狐等动物发病，发病死亡率为30~80%，雪貂高达100%。病毒分离技术是对CDV特性的研究的重要手段，但具有囊膜的CDV不易在环境中存活，因此难以用普通方法分离成功，限制其对CDV的研究。 信号淋巴细胞激活分子（Signaling Lymphocyte Activation Molecule，SLAM）是CDV感染宿主的主要受体，本文旨在建立稳定表达不同动物（犬、狐狸、貉和水貂）SLAM的Vero细胞系，用于CDV分离和体外研究。用PCR的方法以克隆有犬、狐狸、貉和水貂SLAM的Pmd18-T（分别命名Pmd18-T-Cslam、Pmd18-T-Fslam、Pmd18-T-Rslam和Pmd18-T-Mslam）为模板扩增目的基因片段，将其定向插入到真核表达载体Pires2-EGFP中，得到重组表达载体Pires2-EGFP-cSLAMh、Pires2-EGFP-fSLAMh和Pires2-EGFP-mSLAMh。将空载体和已构建完成的重组表达载体分别用脂质体法转染到Vero细胞，通过G418和EGFP筛选稳定表达的阳性Vero细胞。用免疫组化的方法证实SLAM在传了6代转染重组质粒的细胞内的表达。成功建立了稳定表达动物（犬、狐狸、貉和水貂）SLAM的Vero细胞系，分别命名为V-p-cSLAMh、V-p-fSLAMh、V-p-rSLAMh和V-p-mSLAMh细胞系。 对建立的V-p-rSLAMh细胞系进行稳定性、病毒分离敏感性和分离CDV毒力评价。6次冻存复苏的V-p-rSLAMh细胞生长良好，说明细胞稳定性良好。将V-p-rSLAMh细胞系和Vero细胞分别接种3份CD阳性样品，接种3份样品后的细胞系在接毒36～48h形成典型的细胞病变（cytopathic effect，CPE），而在Vero细胞连续盲传6代未见犬瘟热病毒典型CPE，可见建立的细胞系在分离CDV方面比Vero细胞敏感。以V-p-rSLAMh细胞系分离到的LN(（10）f1株CDV进行貉和狐狸攻毒实验，每只的攻毒剂量为4×102.39 TCID50/只，攻毒组3只貉和狐狸在11～22d 死亡，正常对照组貉和狐狸健康存活，说明分离的CDV LN（10）f1株具有较强毒力。H基因序列分析表明该CDV强毒属于Asia-1基因型。 稳定表达SLAM的细胞系的建立为CDV的研究提供了一个有效的操作平台，同时也为CDV强毒株的获得提供保障。

目录

文摘

英文文摘

声明

第1章 绪 论

第2章 表达不同动物犬瘟热病毒受体SLAM的Vero细胞系的建立

第3章 建立的表达貉SLAM受体的Vero细胞系的评价

结 论

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学位论文

致 谢