β-葡聚糖对小鼠单核-巨噬细胞系RAW264.7作用的研究

摘要

背景与目的： 近年来，随着广谱抗生素、抗肿瘤药物、免疫抑制剂及放射治疗的长期应用，尤其是艾滋病患者的增加，使真菌感染的发病率逐年上升。与此同时，临床上抗真菌药物的大量使用，使真菌的耐药性迅速增加，成为真菌感染治疗的一大难题。β-葡聚糖广泛存在于各类真菌的细胞壁中，阐明β-葡聚糖的致病机制，从而消除炎性细胞因子的产生成为目前治疗真菌感染的新思路。本研究的目的是探讨β-葡聚糖对小鼠单核-巨噬细胞系RAW264.7的增殖作用以及对TNF-α表达的影响。旨在探讨ERK1/2信号转导通路在真菌致病过程中的可能作用，从而为真菌感染治疗新药的研究提供实验依据。 方法： β-葡聚糖配制成5μg/ml的溶液， 4℃冰箱保存。使用时用培养液按一定比例稀释。BALB/c小鼠来源的巨噬细胞株RAW264.7在37℃、5％CO2及饱和湿度条件下，体外培养于含10％胎牛血清的RPMI1640培养液中。随时用倒置相差显微镜观察细胞形态，期间换液、传代，取对数生长期RAW264.7细胞，胰酶消化后计数，用培养液调整至合适的细胞密度，进行MTT实验观察β-葡聚糖对RAW264.7细胞增殖的影响；采用ELISA、RT-PCR方法检测TNF-α白以及mRNA的表达情况；Western blot法检测t-ERK及p-ERK蛋白的表达；测定β-葡聚糖刺激作用前后细胞内[Ca2+]i及cAMP浓度变化，观察β-葡聚糖对细胞内第二信使传递系统的影响。 结果： MTT结果显示，β-葡聚糖对细胞增殖的影响与其作用的时间和剂量有关； TNF-α分泌量与β-葡聚糖刺激终浓度以及作用时间选择性相关； Western Blot检测结果显示，在终浓度为100μg/ml的β-葡聚糖刺激作用下RAW264.7细胞内p-ERKl蛋白表达； β-葡聚糖刺激作用前后细胞内[Ca2+]i及cAMP浓度发生改变 结论： 适当浓度的β-葡聚糖可以刺激RAW264.7细胞系的增殖，并且能够剂量依赖性地诱导TNF-α的表达； β-葡聚糖可以明显活化ERK1/2-MAPK信号转导途径； β-葡聚糖刺激RAW264.7细胞内第二信使传递系统[ca2+]i及cAMP浓度的改变，浓度改变幅度与β-葡聚糖的刺激浓度相关。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写索引

声明

第一章绪论

1.1真菌感染趋势

1.2抗真菌药研究现状

1.3单核-巨噬细胞功能研究进展

1.4 β-1,3-D-葡聚糖

第二章研究目的、方法、实验设计方案和意义

2.1研究目的、方法

2.2实验设计方案

2.3研究意义

第三章实验材料

3.1细胞系

3.2主要试剂

3.3主要试剂的配制方法

3.4主要器材

第四章实验方法

4.1 RAW264.7细胞培养

4.2 MTT毒理实验

4.3 ELISA法检测TNF-α表达

4.4 RT-PCR检测TNF-α mRNA的表达水平

4.5 Western blot试验t-ERK1/2及p-ERK1/2N蛋白表达情况

4.6细胞内游离钙离子测定

4.7细胞内cAMP浓度测定

第五章实验结果

5.1 β-葡聚糖对单核巨噬细胞系RAW264.7增殖的影响

5.2 β-葡聚糖对TNF-α表达的影响

5.3 β-葡聚糖对ERK1蛋白表达的影响

5.4 β-葡聚糖对RAW264.7细胞[Ca2+]i及cAMP浓度的影响

第六章讨论

6.1巨噬细胞的增殖

6.2 TNF-α的表达

6.3 ERK1/2信号转导途径

6.4胞内第二信使传递系统

第七章主要结论与展望

7.1主要结论

7.2展望

文献综述 β-葡聚糖信号在巨噬细胞内传递机制的研究进展

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文