灰树花在米糠培养基中液态培养产多糖和富集有机硒的研究

摘要

灰树花是已经引起研究人员重视的一种珍稀食药两用真菌。灰树花多糖可以辅助抗肿瘤治疗、具有增强人体免疫功能等作用。经食用菌等生物转化后的硒也具有毒性小、可提高人体免疫力的功效。米糠是稻米加工过程中的副产品，产量大，有待进行深层次的转化，以提升其价值。本研究中，采用食用菌灰树花在米糠培养基中液体培养产灰树花多糖和富集有机硒，可以将灰树花多糖、有机硒生产和深度转化使用米糠的要求集合到一起加以解决，从而形成新的思路，产生新的工艺，得到新的结果，并为大规模利用廉价原料、工业化生产特定的保健食品奠定基础，因此，本研究有一定的理论和实用价值。
　　 本研究包括的主要内容如下：
　　 (1)研究了灰树花在米糠为主要成分的培养基上液体发酵产多糖的可能性、米糠使用方式和米糠培养基的组成。采用菌种是实验室经紫外诱变挑选的灰树花米糠培养基适性菌种。配制基础培养基：马铃薯(一次煮出液）200g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁0.75g/L，维生素B110mg/L。从基础培养基出发，分别进行了不同碳源、不同氮源、葡萄糖添加量(0.5～2，5％)、米糠添加量(1～5%(wt)）等的单因素试验，选择葡萄糖添加量(1～2%)、米糠添加量(4～6%)和蛋白胨添加量(0.3～0.5%)三个因素进行L9(34)正交试验，并以灰树花菌丝于重和多糖含量作为考察指标。得到了灰树花液态发酵过程中在基础培养基中最优的额外添加物和量分别为：米糠40～60g/L、葡萄糖15g/L、蛋白胨3～4g/L。得到菌丝多糖为281.3mg/100mL，菌丝的平均产量值为1246.7mg/100mL。试验结果表明可以米糠作为主要培养基成分替代或少用葡萄糖等碳源，以降低成本。基础培养基中可以不加马铃薯。米糠的各种使用方式对菌丝多糖影响不是很大。
　　 (2)研究了灰树花在优化的米糠为主要成分的培养基上液体发酵产多糖的外部条件。分别对不同接种量(4～12mL)、装样量(50～150mL)、培养时间(3～8d)、培养温度(22～34℃)、摇床转速(90～210r/min)这五个影响因素进行单因素试验，并以灰树花菌丝干重和菌丝多糖含量作为考察指标。获得了灰树花液体培养的适宜培养条件为：培养时间为5d，培养温度为28℃左右，摇床转速为120～150r/min，接种量为8%，装样量为20%（250mL锥形瓶）。
　　 (3)研究了灰树花在米糠为主要成分的培养基上液体发酵同时富集有机硒和产多糖的作用。通过不同浓度的硒添加量进行硒的单因素试验。按照U12*(1210)均匀设计方法进行了试验，考察硒X1、米糠X2、葡萄糖X3及米糠处理方式X4与菌丝生长量、菌丝多糖含量、有机硒富集量的关系，利用SPSS软件对均匀试验结果进行回归分析。对均匀设计试验结果分别采用多元线性回归和二次多项式回归，获得菌丝干重Y1、多糖含量Y2、硒含量Y3、富硒率Y4的回归方程分别为：Y1=0.070X2+0.234X3+0.209;Y2=0.024X2+0.087X3+0.046;Y3=0.034X1X3-0.009X4+0.118;Y4=0.003X2+0.559X1X3-0.006X2X3+0.022。
　　 (4)在18L发酵罐上进行扩大试验。在发酵优化培养基上，装样量为15L，发酵温度28±1℃，通气量0.8v/v/min，搅拌速度150r/min，罐表压0.05MPa的条件下，发酵培养5d。在发酵时间为2d左右时，菌丝体粗多糖含量达到最大值，为631mg/100mL。同时得到了灰树花在米糠为主的培养基上富集硒和同时生产多糖放大试验的代谢过程，为制定放大生产时的参数和控制指标奠定了理论基础。
　　 (5)对灰树花菌丝体多糖的提取工艺条件进行了优化研究，在单因素试验的基础上，设计考虑交互作用的正交试验L16(215)，通过极差和方差分析，获得提取菌丝体多糖的最佳试验条件为：提取时间为90min、提取温度为75℃、提取次数为2次、乙醇浓度为67v/v。
　　 (6)对粗多糖进行了DEAE-52纤维素层析纯化和性质分析。获得三个纯多糖组分，对纯多糖组分进行理化性质分析，由分析结果可知所得样品确为多糖样品，且均不含淀粉、氨基酸、多肽和蛋白质。同时，在4000～400cm-1区间进行红外光谱扫描分析，经红外光谱分析，可以看出经过分离纯化后所得多糖具有一般多糖类物质的特征吸收峰。