过氧化氢酶与天然抗氧化剂抗氧化协同作用测定方法研究

摘要

过氧化氢酶是一种广泛存在于生物组织中的氧化还原酶，主要生理功能是催化过氧化氢分解为水和氧气，防止细胞过氧化，与超氧化物歧化酶、过氧化物酶和抗坏血酸过氧化物酶一起被称为生物体系的酶防御系统。自由基是机体新陈代谢的产物，在体内大量积累会造成机体的氧化损伤，从而引发多种疾病。抗氧化剂可以清除自由基或活性氧，在病理学和饮食中起着非常重要的作用。近年来很多实验转向研究抗氧化剂间的协同作用，以寻找高效的复合抗氧化剂。本文主要在以下几方面进行了研究:
　　 1、建立了基于钼酸铵显色的高效液相色谱法测定过氧化氢酶活性的方法。实验研究了流动相的组成、pH、比例及流速对反应体系分离的影响，得到的最优的色谱条件为流动相:甲醇-0.5％冰乙酸水溶液(pH2.9)(40:60(V/V));流速:0.5mL/min进样体积:20μL;检测波长:405nm;柱温:室温。研究了酶活测定体系中催化时间、钼酸铵加入量及钼酸铵与过氧化氢反应时间对产物生成量的影响。在最优色谱条件下，体系中各物质在6min内即可分离完成。产物峰面积和迁移时间的相对标准偏差分别为3.36％和0.03％，检出限(S/N=3)为2.58×10-6mol/L。该法可用于过氧化氢酶活性的测定。
　　 2、在抗坏血酸/Fe2+的羟自由基产生体系中，以苯甲酸为羟自由基捕获剂，建立了毛细管电泳测定过氧化氢酶对羟自由基清除率的分析方法。优化了背景缓冲液的pH值、电解质浓度、表面活性剂浓度及分离电压。优化的电泳条件为:缓冲液pH9.2，电解质浓度为10mmol/L，表面活性剂浓度为30mmol/L;分离电压为20kV。在最优电泳条件下，研究了羟自由基产生体系中各底物浓度和反应时间对产物生成量的影响。所建立的方法可在15min内实现体系中的各物质的分离;产物间羟基苯甲酸的线性范围是5×10-6～1×10-3mol/L，检出限为2.8×10-7mol/L。方法可用于过氧化氢酶对羟自由基清除率的测定。
　　 3、研究了天然抗氧化剂原花青素和绿原酸独立抗氧化作用和与过氧化氢酶的协同抗氧化作用。利用建立的测定方法，在灭活血清介质中，测定了原花青素对过氧化氢酶活性的影响;测定了原花青素及绿原酸与过氧化氢酶协同清除羟自由基的作用。实验结果表明，原花青素在25mg/L以下浓度范围内不能提高过氧化氢酶的酶活性，但过氧化氢酶与原花青素及与绿原酸均存在协同清除羟自由基作用，在过氧化氢酶与原花青素的协同作用间还存在着量效关系。

目录

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摘要

第一章 绪论

1．1 过氧化氢酶简介

1．1．1 过氧化氢酶的起源

1．1．2 过氧化氢酶的分类和结构

1．1．3 CAT的生理功能

1．1．4 CAT的来源

1．1．5 CAT的稳定性

1．1．6 CAT的修饰

1．1．7 CAT活性测定方法

1．1．8 过氧化氢酶的应用现状

1．2 抗氧化概述

1．2．1 抗氧化剂作用机理

1．2．2 抗氧化活性评价方法

1．2．3 协同抗氧化作用机理

1．2．4 协同抗氧化作用分析方法

1．2．5 协同抗氧化作用研究进展

1．3 本论文的研究目的、意义及内容

第二章 高效液相色谱法测定过氧化氢酶的活性

2．1 引言

2．2 实验部分

2．2．1 仪器与试剂

2．2．2 色谱条件

2．2．3 实验方法

2．3 结果与讨论

2．3．1 色谱条件的优化

2．3．2 CAT催化反应条件的优化

2．3．3 过氧化氢标准曲线的制作

2．3．4 方法的重现性

2．3．5 酶活测定

2．4 结论

第三章 毛细管电泳法测定过氧化氢酶对羟自由基的清除率

3．1 引言

3．2 实验部分

3．2．1 仪器与试剂

3．2．2 电泳条件

3．2．3 实验方法

3．3 结果与讨论

3．3．1 电泳条件的优化

3．3．2 羟自由基产生体系的确定及产生条件的优化

3．3．3 产物的稳定性及惟一性

3．3．4 方法的重现性和回收率

3．3．5 过氧化氢酶对羟自由基的清除率

3．4 结论

第四章 过氧化氢酶与天然抗氧化剂的抗氧化协同作用研究

4．1 引言

4．2 实验部分

4．2．1 仪器与试剂

4．2．2 色谱和电泳条件

4．2．3 实验方法

4．3 结果与讨论

4．3．1 原花青素对CAT催化活性的影响

4．3．2 原花青素和绿原酸对CAT清除?OH活性的影响

4．4 结论

第五章 结论和展望

参考文献

致谢

攻读硕士期间发表论文