2-酮基-D-葡萄糖酸产生菌膜结合葡萄糖酸脱氢酶的分离纯化及性质

摘要

2-酮基-D-葡萄糖酸(2-keto-D-gluconic acid，2KGA)是目前大规模发酵生产的有机酸之一，具有广泛的工业用途，主要用作食品添加剂D-异抗坏血酸及其钠盐的合成前体。膜结合的葡萄糖酸脱氢酶(gluconate dehydrogenase，GADH，EC1.1.99.3)是葡萄糖代谢特别是2KGA生物合成过程中非常重要的氧化还原酶之一，可特异性地催化底物D-葡萄糖酸为2KGA。
　　本论文对国内2KGA工业生产用菌荧光假单胞菌AR4的GADH进行了分离纯化和鉴定，系统研究了GADH的酶学性质，初步开展了酶促反应和抑制作用动力学的研究，为后续的GADH的过量表达研究乃至2KGA高效生产菌株的构建提供一定的理论依据。
　　主要结论如下:
　　(1)经过超声波破碎细胞、Triton X-114两相分离、硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析以及Hydroxyapatite Fast Flow吸附层析等步骤分离纯化，获得了比活为69.8 U/mg、纯化倍数达116.3倍的荧光假单胞菌AR4的GADH。
　　(2) SDS-PAGE电泳分析结果表明，荧光假单胞菌AR4的GADH具有3个亚基，相对分子质量分别为27.0、45.0和66.0 kDa左右。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析结果证明，从荧光假单胞菌AR4分离纯化的蛋白质确实为膜结合的FAD依赖的GADH，其3个亚基分别为脱氢酶亚基、细胞色素c亚基和功能未知的小亚基。
　　(3)酶学性质研究结果表明，荧光假单胞菌AR4的GADH的最适反应pH值为6.0，最适反应温度为30℃，在pH4.0～7.0和30℃下都具有较好的稳定性;Mg2+和Mn2+对GADH具有促进作用，而Cu2+、Zn2+、Fe3+、一些常用的有机溶剂（甲醇、乙醇、正己烷、丙酮和异戊醇）、丙酮酸钠、2KGA的钙盐和β-巯基乙醇等对该酶具有不同程度的抑制作用;EDTA对GADH几乎没有影响，说明其不属于金属离子依赖性酶;GADH对D-葡萄糖酸具有高度的底物特异性。
　　(4)在pH6.0、30℃和电子受体DCIP-PMS存在的条件下，以D-葡萄糖酸钠为底物，荧光假单胞菌AR4的GADH酶促反应的最大反应速率为0.6μmol/mL·min，米氏常数为0.5 mmol/L;丙酮酸钠和2KGA的钙盐对GADH的抑制类型为竞争性抑制，草氨酸钠为非竞争性抑制，而草酸钠为混合性抑制。

目录

声明

摘要

第一章 综述

1．1 2-酮基-D-葡萄糖酸的性质、应用及生产方法

1．1．1 2-酮基-D-葡萄糖酸的性质

1．1．2 2-酮基-D-葡萄糖酸的应用

1．1．3 2-酮基-D-葡萄糖酸的生产方法

1．2 葡萄糖酸的氧化及其氧化产物的还原

1．2．1 与葡萄糖酸氧化及酮基葡萄糖酸还原相关的酶

1．2．2 GADH与2KGR的比较

1．2．3 GADH的分离纯化及性质研究现状

1．2．4 膜蛋白提取技术

1．3 选题意义

1．4 研究的主要内容

第二章 荧光假单胞菌AR4 GADH的分离纯化

2．1 实验材料

2．1．1 菌种

2．1．2 培养基

2．1．3 试剂与材料

2．1．4 仪器与设备

2．2 实验方法

2．2．1 菌种活化与保藏

2．2．2 菌种扩大培养

2．2．3 细胞收集

2．2．4 超声波破碎细胞

2．2．5 两相分离法提取膜蛋白

2．2．6 硫酸铵沉淀(4℃下操作)

2．2．7 层析(4℃下操作)

2．2．8 细胞浓度(OD650)的测定

2．2．9 葡萄糖的测定

2．2．10 2KGA的测定

2．2．11 GADH的酶活测定

2．2．12 蛋白浓度测定

2．3 结果与讨论

2．3．1 不同生长时期荧光假单胞菌AR4细胞中GADH的相对活性

2．3．2 超声破碎细胞提取GADH的条件优化

2．3．3 两相分离法提取膜蛋白过程中GADH在两相的分配

2．3．4 硫酸铵沉淀GADH酶活性

2．3．5 DBAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析

2．3．6 Hydroxyapatite Fast Flow吸附层析

2．3．7 纯化结果

2．3．8 两相分离法与超速离心法分离提纯GADH比较

2．4 本章小结

第三章 利用SDS-PAGE和MALDI-TOF-MS鉴定荧光假单胞菌AR4 GADH

3．1 实验材料

3．1．1 试剂与材料

3．1．2 仪器与设备

3．2 实验方法

3．2．1 GADH的制备

3．2．2 SDS-PAGE电泳

3．2．3 MALDI-TOF-MS分析

3．3 结果与讨论

3．3．1 来源于荧光假单胞菌AR4的GADH的SDS-PAGE图谱

3．3．2 来源于荧光假单胞菌AR4的GADH的鉴定

3．4 本章小结

第四章 荧光假单胞菌AR4 GADH的酶学性质

4．1 实验材料

4．1．1 试剂与材料

4．1．2 仪器与设备

4．2 实验方法

4．2．1 GADH的制备及酶活测定

4．2．2 酶的最适反应pH与pH稳定性

4．2．3 酶的最适反应温度与热稳定性

4．2．4 金属离子对酶活性的影响

4．2．5 有机溶剂对酶活性的影响

4．2．6 其它试剂对酶活性的影响

4．2．7 底物特异性

4．3 结果与讨论

4．3．1 酶的最适反应pH与pH稳定性

4．3．2 酶的最适反应温度与热稳定性

4．3．3 金属离子对酶活性的影响

4．3．4 有机溶剂对酶活性的影响

4．3．5 其它试剂对酶活性的影响

4．3．6 来源于荧光假单胞菌AR4的GADH的底物特异性

4．3．7 不同微生物来源的GADH部分酶学性质比较

4．4 本章小结

第五章 荧光假单胞菌AR4 GADH的酶促反应和抑制作用动力学

5．1 实验材料

5．1．1 试剂与材料

5．1．2 仪器与设备

5．2 实验方法

5．2．1 GADH的制备及酶活测定方法

5．2．2 单底物的酶促反应动力学

5．2．3 抑制剂对GADH的抑制作用动力学

5．3 结果与讨论

5．3．1 单底物的酶促反应动力学

5．3．2 丙酮酸钠对GADH的抑制作用动力学

5．3．3 2KGCa对GADH的抑制作用动力学

5．3．4 草氨酸钠对GADH的抑制作用动力学

5．3．5 草酸钠对GADH的抑制作用动力学

5．3．6 不同微生物来源的GADH动力学性质比较

5．4 本章小结

第六章 结论与展望

6．1 全文主要结论

6．2 展望

参考文献

致谢

在学期间发表的学术论文

附录1 不同pH下DCIP的毫摩尔消光系数(25℃)

附录2 不同温度下DCIP的毫摩尔消光系数(pH 6．0)