基于深度测序技术的HBV核心启动子区和前C区突变的研究

摘要

目的:基于Ion Torrent PGM深度测序技术建立一种快速、敏感的乙型肝炎病毒(hepatitisB virus，HBV)突变定量检测方法，描述HBeAg阳性慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)患者HBV增强子Ⅱ(enhancerⅡ，EnhⅡ)、基本核心启动子(basal core promoter，BCP)、前C(precore，PC)区突变准种特征，明确HBV病毒变异与病毒和宿主因素间的关系，探讨干扰素序贯治疗过程中BCP突变动态演进模式及其对干扰素抗病毒治疗应答的影响。
　　方法:(1)构建深度测序标准品:
　　克隆测序筛选HBV BCP1762/1764和PC1896突变型和野生型参考质粒，将突变型和野生型参考质粒按比例（0％、0.1％、0.5％、1％、5％、10％、25％、50％和100％）混合，构建系列梯度的HBV突变标准品。
　　(2)构建深度测序文库:
　　巢式PCR扩增HBV EnhⅡ、BCP、PC区片段，PCR产物纯化，2100生物分析仪定量检测扩增子浓度，准备等摩尔比例的混合文库，构建测序模板，标准品及临床样本IonTorrent PGM深度测序。
　　(3)生物信息学分析HBV EnhⅡ、BCP和PC区突变位点及其突变率。
　　结果:(1)Ion Torrent PGM深度测序在1％-100％突变范围内具有较高的准确性(R2＞0.99)和重复性(SE＜1％)。
　　(2)HBV EnhⅡ、BCP和PC区12个突变位点的流行率达20％以上。其中，G1719T、T1753V、A1762T和G1764A与C基因型相关，而A1726C和A1752G/T与B基因型相关。15个核苷酸位点的突变引发了氨基酸改变。
　　(3)BCP A1762T/G1764A双突变常伴PC1896野生型或低频PC G1896A突变。
　　(4)高频BCP A1762T/G1764A突变(≥50％)与较低的HBeAg和HBsAg水平相关;PC G1896A突变(≥10％)与较高的ALT水平相关。
　　(5)干扰素序贯治疗过程中存在5种典型的BCP突变动态演进模式，并影响干扰素抗病毒治疗应答效果;研究提示BCP持续高频突变干扰素抗病毒治疗应答效果最差，BCP突变率逐渐下降应答效果较好。
　　结论:Ion Torrent PGM深度测序可准确定量检测HBV病毒变异，提供HBV感染过程中的相关临床信息，预测干扰素抗病毒治疗应答效果。

目录

声明

摘要

英文缩略语

术语

第一章 引言

1．1 HBV病毒变异

1．2 HBV病毒变异与HBeAg血清学转换和肝脏疾病进展

1．3 HBV病毒变异检测技术

1．4 总结

第二章 研究目的、方法、实验设计方案和意义

2．1 研究目的

2．2 研究方法及实验设计方案

2．3 研究意义

第三章 建立基于Ion Torrent深度测序技术的HBV核心启动子区和前C区变异检测平台

3．1 实验材料

3．1．1 病例选择

3．1．2 主要试剂

3．1．3 主要仪器

3．2 实验方法

3．2．1 患者血清HBV DNA提取

3．2．2 巢式PCR扩增HBV核心启动子区和PC区片段

3．2．3 第2轮PCR产物胶回收纯化

3．2．4 HBVBCP／PC区野生型和突变型参考质粒克隆筛选

3．2．5 HBVBCP／PC突变标准品制备及PCR扩增

3．2．6 Ion Torrent PGM深度测序流程

3．2．7 生物信息学分析

3．2．8 统计分析

3．3 实验结果

3．3．1 HBV EnhⅡ／BCP／PC区巢式PCR扩增

3．3．2 PCR产物直接测序鉴定

3．3．3 PCR产物2100 DNA质量检测

3．3．4 HBV BCP／PC区野生型和突变型参考质粒构建

3．3．5 Ion Torrent PGM深度测序性能确认

3．4 讨论

3．5 小结

第四章 CHB患者HBV EnhⅡ／BCP／PC区突变研究

4．1 实验材料

4．1．1 主要试剂

4．1．2 主要仪器

4．2 实验方法

4．2．1 患者临床指标检测

4．2．2 统计分析

4．3 实验结果

4．3．1 研究队列特征

4．3．2 HBV EnhⅡ／BCP／PC区突变情况

4．3．3 HBV BCP A1762T／G1764A和PC G1896A突变组合模式

4．3．4 HBV BCP和PC突变分层聚类分析

4．3．5 HBV EnhⅡ／BCP／PC区突变引发氨基酸改变

4．4 讨论

4．5 小结

第五章 HBV BCP和PC区突变与干扰素治疗应答关系的研究

5．1 实验材料

5．1．1 干扰素治疗方案

5．2 实验方法

5．2．1 统计分析

5．3 实验结果

5．3．1 干扰素抗病毒治疗疗效判定

5．3．2 干扰素序贯治疗期间BCP突变动态演进模式

5．3．3 BCP突变动态演进模式影响干扰素抗病毒应答

5．4 讨论

5．5 小结

第六章 结论与展望

6．1 主要结论

6．2 展望

第七章 综述 乙肝病毒变异与乙肝相关肝脏疾病关系的研究进展

参考文献

致谢

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