变形假单胞菌2-酮基葡萄糖酸利用操纵子的初步研究

摘要

2-酮基葡萄糖酸（2-ketogluconic acid,2KGA）是目前国际上规模化发酵生产的有机酸之一，主要用作食品抗氧化剂D-异抗坏血酸及其钠盐合成的前体。本论文旨在从国内2KGA生产的主要工业用菌——变形假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）JUIM01中克隆调控发酵目的产物分解代谢的2-酮基葡萄糖酸利用操纵子即 kgu操纵子（2-ketogluconate utilization operon, kgu operon），并明确其基因的组成和生物学信息，在此基础上采用异源表达和基因敲除等技术对其结构基因的功能进行初步验证，为从分子水平上研究2KGA的代谢机理奠定基础，进而为有效提高2KGA的发酵生产效率提供重要的理论指导。主要结论如下：
　　（1）采用 LA-PCR技术首次从变形假单胞菌中克隆了含有 kgu操纵子完整序列的基因片段，其核苷酸序列长度为6130 bp，其中包括基因ptxS、kguE、kguK、kguT和kguD，预测其分别编码转录调控蛋白 PtxS、2-酮基葡萄糖酸异构酶（KguE）、2-酮基葡萄糖酸激酶（KguK）、2-酮基葡萄糖酸转运蛋白（KguT）和2-酮基葡萄糖酸还原酶（KguD）。对非编码区核苷酸序列的分析结果表明，从变形假单胞菌JUIM01中克隆的基因片段中可能存在两个操纵子，分别为ptxS操纵子和kgu操纵子，即变形假单胞菌JUIM01的kgu操纵子仅由kguE、kguK、kguT和kguD等4个结构基因组成。
　　（2）基于变形假单胞菌 kgu操纵子的生物信息学分析结果，采用 TD-PCR技术克隆了kguE和kguD的完整序列，在此基础上构建了重组菌株E. coli BL21(DE3)/pET-28a-kguE和E. coli BL21(DE3)/pET-28a-kguD。SDS-PAGE及Western-Blot分析结果表明，目的基因kguE和kguD在E. coli BL21(DE3)中均得到了成功表达，且表达的重组蛋白的分子质量分别约为29.0 ku和36.0 ku，与采用生物信息学方法预测的KguE和KguD的分子质量相符。酶活测定结果表明，kguD编码的KguD可能参与了2KGA的分解代谢。
　　（3）基于变形假单胞菌 kgu操纵子的生物信息学分析结果，分别采用 TD-PCR技术和overlap-PCR技术克隆了kguT基因的完整序列和kguT缺失片段，在此基础上构建了基因敲除菌株 Ps. plecoglossicida JUIM01△kguT和基因回补菌株 Ps. plecoglossicida JUIM01△kguT-pBBR1MCS-2-kguT。2KGA利用实验结果表明，在2KGA钙盐作为唯一碳源的M9培养基上，基因敲除菌株不能生长而基因回补菌株能够生长，说明kguT基因编码的蛋白参与了2KGA的分解代谢。本实验获得的基因敲除菌株 Ps. plecoglossicida JUIM01△kguT能够有效阻断2KGA的代谢途径，在2KGA的发酵生产中具有一定的优势，有利于降低生产成本，有望应用于2KGA的工业生产中。

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第一章 绪论

1.1 2-酮基葡萄糖酸概述

1.2 假单胞菌2-酮基葡萄糖酸的合成与代谢

1.3 基因敲除技术及其应用

1.4 选题背景及意义

1.5 研究的主要内容

第二章 变形假单胞菌2-酮基葡萄糖酸操纵子的克隆及生物信息学分析

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 实验结果及分析

2.4 本章小结

第三章 变形假单胞菌2-酮基葡萄糖酸还原酶及2-酮基葡萄糖酸异构酶基因的克隆与表达

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 实验结果

3.4 本章小结

第四章 2-酮基葡萄糖酸转运蛋白基因的敲除及其对变形假单胞菌

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3 实验结果及分析

4.4 本章小结

第五章 结论与展望

5.1 全文主要结论

5.2 存在问题及展望

参考文献

致谢

在攻读硕士学位期间发表的论文