碳量子点介导的基因传递与体细胞神经分化研究

摘要

目前，细胞替代疗法是修复受损或病变中枢神经系统的有效手段，直接重编程技术能够将体细胞直接转换为神经干细胞(iNSCs)或神经元(iNs)，可作为替代疗法的细胞来源，促进中枢神经系统的功能恢复。然而，在现代细胞重编程研究中多采用病毒作为基因载体，存在着基因突变、致瘤等安全隐患，碳量子点（CDs）作为一种新兴的碳纳米材料，是一种尺寸不超过10 nm的球形碳纳米颗粒。碳量子点除具备优异的光学性能外，还拥有其他量子点无法媲美的高生物相容性和低细胞毒性，故在生物医药领域备受关注，可应用于荧光探针、生物成像、生化检测和药物传递等。近两年，逐渐有报道将碳量子点应用于基因载体，但是关于转运机制等仍有待进一步探究。本课题拟利用海藻酸钠为原材料，水热合成法制备一种 CDs，并将它与 DNA结合自组装为纳米粒，作为多功能基因转导系统开展体细胞向神经分化的研究。
　　第一章综述
　　本章主要阐述了研究对象，即碳量子点（CDs）不同的合成方法、性质及其在多领域的应用，重点论述了不同制备方法的优缺点和不同领域的应用前景，为CDs作为基因载体的研究提供可行性参考；同时，还围绕体细胞重编程为神经干细胞或神经元的发展作简单介绍，包括不同细胞来源、不同重编程方法的特点，并对其未来发展趋势和面临问题进行展望。最后，提出本课题的选题依据及思路，为论文的后续工作奠定基础。
　　第二章碳量子点的制备与表征
　　本章主要将海藻酸钠和3%过氧化氢作为反应物，通过水热法制备得到荧光多糖碳点（CP-CDs）。利用 TEM、Zeta电位及荧光光谱等对其表征发现，本课题中制备的 CP-CDs平均粒径在7 nm左右，为类球形颗粒，水分散性良好，表面带有正电荷，并且具有激发光波长依赖性，可在不同波长激发光的照射下发射蓝色、绿色及红色三种颜色的荧光，荧光稳定性强；利用元素分析、XPS对原材料海藻酸钠进行考察，发现海藻酸钠中含有 N杂质，β消除反应证实其中含有以 O-糖肽方式连接的糖蛋白。因此，我们推断海藻酸钠在反应中既作为碳源，又能作为阳离子化试剂，对 CP-CDs表面进行钝化修饰，提高其荧光性能。
　　第三章碳量子点作为基因载体的初步研究
　　本章主要围绕 CP-CDs能否作为基因载体展开工作，琼脂糖凝胶电泳结果表明当 CP-CDs与 DNA质量比为40：1时可有效结合 DNA。在此基础上，将 CP-CDs与 DNA自组装成纳米粒，考察纳米粒的细胞毒性、对 DNA的保护、基因转染效率、细胞内转运及摄取机理等。实验结果表明，CP-CDs/DNA纳米粒对3T6细胞几乎无毒性，可保护 DNA不被外界的核酶降解，其转染效率明显高于 PEI和市售试剂 Lip2000；转染后4个小时细胞核内发现目的基因，但是 CP-CDs未进核，而是将 DNA释放后自身留在核外；吞噬抑制实验发现小窝蛋白介导的细胞内吞和网格蛋白介导的内吞作用是纳米粒携带基因进入细胞的主要途径。
　　第四章碳量子点介导的体细胞重编程研究
　　本章主要以碳量子点作为基因载体，分别与五组基因组合自组装成纳米粒，体外转染 MEF细胞，将其直接转换为 iNSCs，并定向分化为神经元，考察碳量子首次作为载体在细胞重编程中的应用潜力，并筛选最佳因子组合。结果表明，诱导后的 MEF细胞不但形态上类似 iNSCs，还可表达 iNSCs特异性标志物—Nestin和 Pax；诱导 iNSCs向神经元分化，发现 iNs可表达 MAP2、Tau和Tuj1三种神经元标志物；同时，对各组实验结果对比分析后，筛选出 Ascl1+Brn2双因子组合的转染效率最高，为最佳因子组合。

目录

声明

引言

第一章 综 述

1.1基因载体简介

1.2 碳量子点研究进展

1.3 神经细胞重编程研究进展

1.4 本论文的研究意义及内容

第二章 碳量子点的制备与表征

2.1 仪器与试剂

2.2 实验与方法

2.3 结果与讨论

2.4 本章小结

第三章 碳量子点作为基因载体的初步研究

3.1 仪器与试剂

3.2 实验方法

3.3 结果与讨论

3.4 本章小结

第四章 碳量子点介导的体细胞重编程研究

4.1 仪器与试剂

4.2 实验方法

4.3 结果与讨论

4.4 本章小结

全文总结

参考文献

致谢

攻读硕士期间已发表或完成的论文