玫瑰茄多糖的分离纯化、结构表征、免疫活性及其机制研究

摘要

玫瑰茄(Hibiscus sabdariffa L.)又名洛神花、芙蓉花，是锦葵科木槿属一年生草本植物，是一种营养丰富的药食两用植物，含有花色苷、多酚、有机酸和多糖等多种活性成分，具有调节免疫力、抗肿瘤、抗氧化和抗辐射等生物活性，已被列入可用于保健食品的物品名单。目前，玫瑰茄的研究主要集中在花色苷和多酚等方面，关于多糖的研究报道较少。因此，本文以玫瑰茄花萼多糖为研究对象，对其进行提取、分离和纯化，获得低分子量多糖组分HSP11；运用红外光谱（IR）、高效凝胶色谱（GPC）、气相色谱-质谱（GC-MS）、核磁共振（NMR）和原子力显微镜（AFM）等对该多糖组分的结构进行表征；同时研究该多糖组分对环磷酰胺（CTX）免疫抑制小鼠的免疫调节活性及其免疫调节作用机制，为玫瑰茄多糖的研究与应用提供依据，为玫瑰茄资源的综合利用提供新途径，该研究对人类健康和社会经济发展具有重要意义。 主要研究内容如下： （1）玫瑰茄多糖的提取工艺和分离纯化研究。采用响应面（RSM）法优化玫瑰茄粗多糖的提取工艺，最佳提取工艺条件为：料液比1:26（g/mL）、提取温度90℃、提取时间3.1 h，在该工艺条件下粗多糖得率为14.41%；采用DEAE-Cellulose-52和Sephadex G-200凝胶柱对玫瑰茄粗多糖进行分离纯化，获得3个多糖组分HSP11、HSP31和HSP41，其多糖含量分别为93.39%、90.82%和92.56%；GPC和GC分析结果表明，其分子量分别为6276、441133和580344 Da，单糖组成分别为：HSP11（葡萄糖:半乳糖=3.03:1）、HSP31（木糖:甘露糖:葡萄糖:半乳糖=1:3.21:1.52:1.18）和HSP41 （阿拉伯糖:木糖:甘露糖=1:1.34:15.6），其中水洗组分HSP11的得率最高。 （2）玫瑰茄多糖组分HSP11的结构研究。通过IR、甲基化、GC-MS、1H NMR、13C NMR、1H-1H COSY谱、HSQC谱及HMBC谱等分析手段对HSP11的一级结构进行解析，推测其一级结构的重复单元为： (此处为公式省略) AFM研究发现，HSP11分子间相互缠绕，呈大小不一的团聚状。 （3）HSP11对CTX免疫抑制小鼠的免疫调节作用研究。采用CTX免疫抑制小鼠模型，研究HSP11的免疫调节作用。结果表明，高剂量的HSP11(120 mg/kg/d)能极显著提高免疫抑制小鼠的胸腺指数、单核-巨噬细胞吞噬指数、血清溶血素水平和迟发型变态反应，极显著促进血清中INF-γ细胞因子的水平及外周血中白细胞、淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞的含量；高剂量的HSP11还可显著提高免疫抑制小鼠的脾脏指数和血清中免疫球蛋白（IgA、IgM和IgG）和IL-2的水平；HSP11可通过増强免疫抑制小鼠的体液免疫、细胞免疫及免疫器官指数而改善CTX的免疫抑制作用，恢复并提升小鼠的免疫力，发挥免疫增强作用。HSP11对CTX免疫抑制小鼠具有免疫调节活性。 （4）HSP11的免疫调节作用机制研究。以小鼠腹腔单核巨噬细胞RAW264.7为模型，研究HSP11的免疫调节作用机制，结果表明：在62.5～1000μg/mL浓度范围内，HSP11可极显著刺激RAW264.7细胞产生ROS；显著提高RAW264.7细胞中IL-1β、TNF-α和iNOS细胞因子的水平（p<0.05或p<0.01），并呈一定的剂量依赖性；HSP11可显著促进RAW264.7细胞IL-1β、TNF-α和iNOS基因的表达（p<0.05或p<0.01）；显著上调MAPK通路中ERK、p38和JNK三个亚基蛋白的磷酸化水平（p<0.05或p<0.01），该磷酸化水平可被特异性阻断剂（PD98059、SB203580和SP600125）阻断，同时HSP11使NF-κB发生核易位，细胞核内NF-κBp65极显著增多。结果提示HSP11可能是通过MAPK和NF-κB信号通路激活RAW264.7细胞，启动免疫应答反应，提高RAW264.7细胞的免疫能力。

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摘 要

ABSTRACT

缩写与符号

第一章 绪 论

1.1 多糖的研究概况

1.1.1 多糖的提取方法

1.1.2 多糖的纯化方法

1.1.3 多糖的生物活性

1.2 玫瑰茄的研究进展

1.2.1 玫瑰茄的植物学特性

1.2.2 玫瑰茄的营养成分和化学成分

1.2.3 玫瑰茄多糖的研究进展

1.3 本课题研究的目的和意义

1.4 研究思路和主要研究内容

第二章玫瑰茄多糖的提取、分离与纯化研究

2.1 仪器、材料与试剂

2.1.1 仪器

2.1.2 材料与试剂

2.2 实验方法

2.2.1 原料预处理

2.2.2 玫瑰茄粗多糖的提取

2.2.3 单因素实验

2.2.4 响应面分析实验

2.2.5 玫瑰茄多糖的分离与纯化

2.2.6 多糖的理化性质测定

2.2.8 分子量的测定

2.2.9 单糖组成分析

2.2.10 统计分析

2.3 结果与讨论

2.3.1 单因素实验结果

2.3.2 响应面分析结果

2.3.3 验证实验结果

2.3.4 玫瑰茄多糖的分离与纯化结果

2.3.5玫瑰茄多糖组分的理化性质

2.3.6多糖组分的分子量

2.3.7单糖组成分析结果

2.4本章小结

第三章 玫瑰茄多糖组分HSP11的结构表征

3.1仪器、材料与试剂

3.1.1仪器

3.1.2材料与试剂

3.2 实验方法

3.2.3 甲基化多糖样品的水解及糖腈乙酸酯衍生物的制备

3.2.4 衍生物的GC-MS分析

3.2.5 HSP11核磁共振波谱的测定

3.2.6 HSP11原子力显微镜分析

3.3 结果与讨论

3.3.1 HSP11红外光谱的分析结果

3.3.2 甲基化反应及GC-MS分析结果

3.3.3 NMR结果分析

3.3.4 HSP11原子力显微镜分析结果

3.4本章小节

第四章 HSP11对CTX免疫抑制小鼠的免疫调节活性研究

4.1 仪器、材料与试剂

4.1.1 仪器

4.1.2 材料与试剂

4.2实验方法

4.2.1动物处理及分组

4.2.2脏器指数分析

4.2.3碳廓清实验

4.2.6小鼠细胞因子及血生化的测定

4.2.7 统计分析

4.3 结果与分析

4.3.1 HSP11对CTX免疫抑制小鼠体重增长率和脏器指数的影响

4.2.2 HSP11对CTX免疫抑制小鼠非特异性免疫功能的影响

4.2.3 HSP11对CTX免疫抑制小鼠血清溶血素水平的影响

4.2.4 HSP11对CTX免疫抑制小鼠迟发型变态反应的影响

4.2.5 HSP11对CTX免疫抑制小鼠血清IL-2和INF-γ水平的影响

4.2.6 HSP11对CTX免疫抑制小鼠血清IgA、IgM和IgG含量的影响

4.2.7 HSP11对CTX免疫抑制小鼠血细胞的影响

4.4本章小结

第五章 HSP11免疫调节活性机制研究

5.1仪器、材料与试剂

5.1.1仪器

5.1.2 材料与试剂

5.2 实验方法

5.2.1 细胞的培养

5.2.2 HSP11对RAW264.7细胞生长的影响

5.2.3 HSP11对RAW264.7细胞中ROS表达水平的影响

5.2.4 HSP11对RAW264.7细胞中细胞因子IL-1β、TNF-α和iNOS表达水平的影响

5.2.5 HSP11对RAW264.7细胞中IL-1β、TNF-α和iNOS基因表达的影响

5.2.6 HSP11对MAPK通路相关蛋白表达水平的影响

5.2.7阻断剂对HSP11作用下MAPK通路相关蛋白表达水平的影响

5.2.8 HSP11对NF-κBp65在RAW264.7细胞中分布的影响

5.2.9 HSP11对NF-κBp65在RAW264.7细胞核中表达的影响

5.2.10 统计分析

5.3 结果与讨论

5.3.1 HSP11对RAW264.7细胞外部形态变化的影响

5.3.2 HSP11对RAW264.7细胞活性的影响

5.3.3 HSP11对RAW264.7细胞ROS的影响

5.3.4 HSP11对RAW264.7细胞释放细胞因子的影响

5.3.5 HSP11对MAPK信号通路相关基因表达的影响

5.3.6 HSP11对MAPK信号通路相关蛋白表达的影响

5.3.7 阻断剂对HSP11作用下MAPK信号通路相关蛋白表达的影响

5.3.8 HSP11对NF-κB p65在RAW264.7细胞中分布的影响

第六章 结论与展望

6.1 主要结论

6.2 创新点

6.3 展望

参考文献

致 谢

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