19-去甲睾酮胶体金免疫层析试纸条的研制

摘要

本研究选择19-去甲睾酮(19-nortestosterone，19-NT)为研究对象，研制了用于检测19-NT残留的竞争性胶体金免疫层析试纸条。利用胶体金的显色原理达到快速检测样品中19-NT的残留。 将19-去甲睾酮经羧甲基羟胺肟化，然后采用混合酸酐法将肟化产物分别与牛血清蛋白(bovineserum albumin，BSA)和卵清白蛋白(ovalbumin，OVA)偶联，分别制备19-NT免疫原和包被抗原。采用柠檬酸三钠还原法制备了18.6nm左右的胶体金溶液。在标记19-NT多克隆抗体时，最佳pH值范围在8.6～9.8之间，最适标记抗体浓度为30μg/ml。选用Waterman公司的Purabind RP硝酸纤维膜，德国Schleicher&Schuell公司的Glass33玻璃纤维膜，上海金标有限公司的CB-SB08玻璃纤维膜、吸水纸、PVC底板组装成试纸条。其中每垫金标垫上喷涂2×稀释的60μl金标抗体，检测线和质控线分别用Bio-dot XYZ3000金标点样仪喷涂0.5mg/ml的19-NT-OVA包被抗原和0.2mg/ml的羊抗兔IgG二抗。用试纸条检测19-NT标准溶液，检测限为180ng/ml，检测添加19-NT的猪尿样本时，检测限为200ng/ml，通过使用ImagJ软件对试纸条进行定量分析，可以得到的检测限为25ng/ml。 本实验研究的试纸条优点是简便、快速，15min内就可以得到检测结果，适用于现场检测。本研究为19-NT胶体金试纸条的深入研究提供了重要的实验依据，也对食品中其它小分子兽药残留检测试纸条的研制提供了基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：主要中英文缩写

声明

第一章绪论

1.1 19-去甲睾酮概论

1.1.1 NT的理化性质

1.1.2 NT的药理性质

1.2 NT的残留与危害

1.3胶体金免疫分析检测技术

1.4本课题研究内容、目标

第二章材料与方法

2.1主要试剂

2.2主要仪器

2.3试纸条材料

2.4主要溶液

2.4.1抗原稀释液(A)

2.4.2金标抗体稀释液(B)

2.4.3封闭液(C)

2.5主要溶液配制

2.7抗原合成

2.7.1 19-NT免疫原的合成

2.7.2包被抗原(19-NT-OVA)的制备

2.8抗体制备

2.8.1抗血清的制备

2.8.2抗体浓度测定

2.9胶体金的制备

2.9.1玻璃器皿的准备

2.9.2试剂的配制要求

2.9.3柠檬酸三钠还原法制备胶体金

2.9.4胶体金的质量鉴定

2.10胶体金标记抗体蛋白

2.10.1抗体蛋白前处理

2.10.2标记蛋白最佳pH值的确定

2.10.3胶体金标记最佳抗体蛋白浓度的确定

2.10.4胶体金标记抗体蛋白

2.10.5金标抗体的纯化

2.10.6金标抗体的活性鉴定

2.11溶液系统的筛选

2.11.1抗原稀释液的选择

2.11.2金标抗体稀释液的选择

2.11.3封闭液的选择

2.12试纸条制备材料的选择

2.12.1硝酸纤维膜的选择

2.12.2结合释放垫的选择

2.12.3样品垫的选择

2.13金标抗体浓度及在结合垫上喷涂量的选择

2.14 NC膜上抗原与二抗包被浓度的选择

2.15试纸条的组装

2.16试纸条的测试方法

2.17试纸条质量性能测试

2.17.1灵敏度测试

2.17.2特异性测试

2.17.3重复性测试

2.17.4稳定性测试

2.17.5猪尿样本添加检测及仪器检测确证

2.17.6胶体金试纸条的半定量检测初步研究

第三章结果与分析

3.1抗体浓度测定

3.2胶体金的质量鉴定

3.1.1肉眼观察

3.1.2紫外扫描

3.1.3透射电镜观察

3.3胶体金标记抗体蛋白

3.3.1标记抗体蛋白最佳pH值的确定

3.3.2胶体金标记最佳抗体蛋白浓度的确定

3.3.3金标抗体的活性鉴定

3.4溶液系统的筛选

3.4.1抗原稀释液的选择

3.4.2金标抗体稀释液的选择

3.4.3封闭液的选择

3.5试纸条制备材料的选择

3.5.1硝酸纤维膜的选择

3.5.2结合释放垫的选择

3.5.3样品垫的选择

3.6金标抗体浓度及在结合垫上喷涂量的选择

3.7 NC膜上抗原与二抗包被浓度的选择

3.8试纸条的组装与测试

3.9试纸条质量性能测试

3.9.1灵敏度测试

3.9.2特异性测试

3.9.3重复性测试

3.9.4稳定性测试

3.9.5猪尿样本添加检测及与仪器检测确证

3.9.6胶体金试纸条的定量分析初步研究

第四章讨论

4.1胶体金的制备

4.2胶体金的标记

4.3胶体金试纸条的定量分析研究

第五章结论及展望

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文