冬小麦麸皮抗冻蛋白结构及其抗冻机理的研究

摘要

抗冻蛋白(AFP，antifreezeprotein)是一种可以非依数性降低冰点、抑制体系发生重结晶特性的蛋白质，广泛地分布在鱼类、动物、昆虫、植物以及微生物中，是生命体抵御外界寒冷环境应激性反应所产生的一种蛋白。据报道，AFP具有提高产品质量，提高农作物抗寒能力，提高冷冻体细胞存活率等作用，广泛地应用于食品、生物、临床医学和化工等领域。本文以谷物原料进行筛选，发现冬小麦麸皮中存在AFP，并进一步对冬小麦麸皮抗冻蛋白(TaAFP)进行分离纯化，研究其理化特性、一级结构和二级结构，并以一级结构为基础，探讨TaAFP与冰晶的结合方式，揭示其抗冻机理。 论文首先研究了AFP的检测方法。文中比较了目前常用AFP的检测方法，发现差热分析仪法(DSC)具有样品用量小、可以精确控制温度、可以获得准确结果等优点，因此确定DSC法为本文AFP抗冻活性(THA)的检测方法。还进一步研究了影响测定结果的各个因素，考察使用DSC法测定THA的稳定性、重复性和精密度，结果显示DSC法测定样品THA具有较高的稳定性、重复性和精密度，其RSD在0.4％以下，相对标准偏差为3.84％。具体的测定程序如下：样品溶解于10mmol/L，磷酸盐缓冲液(pH8.0)达到最终蛋白浓度1.0mg/mL，将10μL样品在坩埚中平衡15min后，按照1.0℃/min的速度进行升降温，在保留温度Th时，保持体系的冰晶质量含量占体系的10％-90％(质量分数)。 从多种谷物中筛选AFP，并对其进行分离纯化。筛选结果发现在冬小麦麸皮中存在AFP，进一步分别采用传统的分离法、特异性亲和法和条带切割法对冬小麦麸皮抗冻蛋白(TaAFP)纯化，均获得电泳纯的样品。比较三种纯化方法的优缺点：传统的分离纯化方法在AFP或其它活性物质的筛选中具有普遍适用性；特异性亲和分离纯化法将来可能会适用于AFP大规模的粗分离；电泳条带切割法适用于高精度和高纯度样品的纯化和分析。 研究了TaAFP的物理与化学性质，结果发现TaAFP中无糖基。氨基酸分析结果推测TaAFP由155个氨基酸残基组成，相对分子质量13085.2。其中，Glycine残基占52.26％(摩尔百分含量)，属于富甘氨酸蛋白(GRP)。使用ExPASy数据库检索与TaAFP相关的GRP发现，TaAFP是一种与冷诱导或其它诱导相关的蛋白。TaAFP的变性温度为61.47℃，变性后，THA丧失，属于热不稳定型AFP。TaAFP在微碱性的环境中(pH7.0-9.0)显示较高的THA，该环境恰好与植物的生理状态环境一致。TaAFP属于Ca6+-dependendAFP，在Ca2+存在的情况下，RHA得到增强。TaAFP还具有AFP所应有的亲水性和较高的分配系数(质量分数大于90％)。 MALDI-TOF-MS分析结果显示TaAFP的相对分子质量为13637.711，与上述SDS-PAGE和氨基酸分析推测获得的结果基本吻合。进一步采用了结合N-末端测定和肽指纹图谱的分析方法测定TaAFP的一级结构，结果表明其一级结构为：MARKVIALAFLLLTISLSKSNAARVKYNGGESGGGGGGGGGGGGGGNGSGSGSGYGYNYGKGGGQSGGGQGGGGGGGGGGGSNGSGSGSGYGYGYGQGNGGAQGQGSGGGGGGGGGGGGGGSGQGSGSGYGYGYGKGGGGGGGGGGDGGGGGGGGSAYVGRHE，测定覆盖度达到100％。TaAFP的二级结构分别采用圆二色性光谱、拉曼光谱、红外光谱以及生物信息学的预测方法测定。TaAFP中a-helix的含量为10％-15％；β-sheet的含量为10％-20％，randomcoil的含量为40％-60％。 采用分子力学和量子力学的方法研究了TaAFP和(1121)冰晶面的结合情况。计算结果显示蛋白面M1(Metl、Lys4、Gly47、Asn48、Ser50、Gly51、Gly138、Gly139、Gly141、Gly142、Gly143、Gly161、Arg162、His163和Glu164)与冰晶面具有最强的结合能力。其中，静电作用和范德华作用大大超过了氢键的作用。另一方面，运用半经验量子力学的方法AM1和PM3进一步获得了TaAFP与冰晶面的微观相互作用。首先，当TaAFP与冰晶面作用时，蛋白面M1和冰晶之间发生弱轨道相互作用，AM1和PM3的计算结果均显示面M1与冰晶面之间的弱轨道相互作用是最强的。第二，半经验量子力学计算证实TaAFP与冰晶面之间存在电荷迁移，对整个体系而言，电子是从TaAFP迁移到冰晶上。因此，TaAFP与冰晶相互作用增强。第三，键级能的计算结果显示各个蛋白面与冰晶面的键级能基本上相当，其中，M1属于相互作用较强的面。因此，确定蛋白面M1是TaAFP与冰晶的最佳结合面。 TaAFP的抗冻机理就在于M1通过库仑作用、范德华作用、轨道重合和电荷迁移等相互作用与冰晶面紧密的结合。当M1与冰晶面结合后TaAFP锚定于冰晶表面，冰晶如果继续生长，则冰晶的表面积需要增加，而冰晶表面积的增加则需要外界进一步提供能量。提供能量后，系统的熵降低，体系温度下降。在宏观上则表现为冰晶需要更低的温度才可以进一步生长，体系的冰点被降低，即产生热滞现象。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语对照表

声明

第一章 绪论

1.1.抗冻蛋白的分类及其特点

1.1.1.抗冻蛋白的分类

1.1.2.抗冻蛋白的特性

1.2.抗冻蛋白热滞活性的检测方法

1.2.1.毛细管单晶生长法

1.2.2.差示扫描量热法

1.2.3.微量渗透压计法

1.2.4.其它方法

1.3.抗冻蛋白的分离纯化

1.3.1.血清中抗冻蛋白的分离纯化

1.3.2.动物组织中抗冻蛋白的分离纯化

1.3.3.植物中抗冻蛋白的分离纯化

1.3.4.抗冻蛋白的特异性亲和分离纯化

1.4.抗冻蛋白的结构研究

1.4.1.鱼类抗冻蛋白

1.4.2.植物抗冻蛋白

1.4.3.昆虫抗冻蛋白

1.5.抗冻蛋白的抗冻机理研究

1.5.1.吸附-抑制模型

1.5.2.晶格匹配模型

1.5.3.偶极子-偶极子模型

1.5.4.品格占有模型

1.5.5.氢原子结合模型

1.5.6.刚体能量模型

1.5.7.表面互补模型

1.6.分子模拟研究抗冻蛋白抗冻机理

1.6.1.分子模拟的基本方法

1.6.2.分子模拟在抗冻蛋白研究中的应用

1.7.抗冻蛋白的应用研究

1.7.1.抗冻蛋白在食品工业中的应用

1.7.2.抗冻蛋白在器官保藏中的应用

1.7.3.抗冻蛋白在基因工程改善植物抗冻性的应用

1.7.4.抗冻蛋白在其它行业中的应用

1.8.课题的研究意义以及研究内容

1.8.1.课题的研究意义

1.8.2.课题的研究内容

1.9.参考文献

第二章抗冻蛋白抗冻活性检测方法的研究

2.1.材料与方法

2.1.1.实验材料

2.1.2.实验设备

2.1.3.实验方法

2.2.结果与讨论

2.2.1.DcAFP的分离纯化

2.2.2.升降温速率对THA的影响

2.2.3.原料浓度对THA的影响

2.2.4.冰晶含量对THA的影响

2.2.5.DSC法检测THA稳定性的研究

2.2.6.DSC法检测THA重复性的研究

2.2.7.DSC法检测THA精密度的研究

2.3结论

2.4参考文献

第三章冬小麦麸皮抗冻蛋白分离纯化的研究

3.1.材料与方法

3.1.1.实验材料

3.1.2.实验设备

3.1.3.实验方法

3.2.结果与讨论

3.2.1.抗冻蛋白的筛选结果

3.2.2.冬小麦麸皮的基本成分

3.2.3.TaAFP的传统分离方法

3.2.4.TaAFP的特异性亲和分离方法

3.2.5.TaAFP的电泳条带切割分离纯化

3.2.6.三种分离方法获得的TaAFP的比较

3.3.结论

3.4.参考文献

第四章冬小麦麸皮抗冻蛋白性质的研究

4.1.材料与方法

4.1.1.实验材料

4.1.2.实验设备

4.1.3.实验方法

4.2.结果与讨论

4.2.1.TaAFP的电泳分析结果

4.2.2.TaAFP的氨基酸组成

4.2.3.TaAFP的变性温度以及其THA的变化

4.2.4.pH值和阳离子对TaAFP的THA活性的影响

4.2.5.TaAFP的亲水能力

4.2.6.TaAFP的疏水能力

4.2.7.TaAFP在冰晶相和液相的分配系数

4.3.结论

4.4.参考文献

第五章 冬小麦麸皮抗冻蛋白结构的研究

5.1.材料与方法

5.1.1.实验材料与设备

5.1.2.实验方法

5.2.结果与讨论

5.2.1.TaAFP相对分子质量的确定

5.2.2.TaAFP序列的分析和确定

5.2.3.TaAFP同源性分析结果

5.2.4.TaAFP紫外光谱检测结果

5.2.5.TaAFP圆二色性光谱检测结果

5.2.6.TaAFP Raman光谱检测结果

5.2.7.TaAFP FT-IR检测结果

5.2.8.使用生物信息学方法预测TaAFP二级结构的结果

5.2.9.TaAFP二级结构的总结

5.3.结论

5.4.参考文献

第六章冬小麦麸皮抗冻蛋白抗冻机理的研究

6.1.实验方法

6.1.1.TaAFP的同源建模

6.1.2.蛋白表面的选择和划分

6.1.3.冰面的构建

6.1.4.TaAFP-冰晶相互结合的模拟

6.1.5.分子力学理论计算最佳TaAFP-冰晶结合面

6.1.6.量子力学理论计算最佳TaAFP-冰晶结合面

6.2.结果与讨论

6.2.1.TaAFP的建模结果

6.2.2.TaAFP蛋白表面区域划分结果

6.2.3.分子力学方法计算TaAFP与冰晶面之间的相互作用能

6.2.4.体系总能量对TaAFP与冰晶面之间相互作用能的影响

6.2.5.分子轨道重叠对TaAFP与冰晶面之间相互作用能的影响

6.2.6.电荷迁移作用对TaAFP与冰晶面之间相互作用能的影响

6.2.7.键级能对TaAFP与冰晶面之间相互作用能的影响

6.2.8.TaAFP与冰面结合的模型

6.3.结论

6.4.参考文献

论文主要结论及主要创新点

攻读博士学位期间主要学术成果

致谢