动物源性食品中硝基呋喃类药物残留分析研究

摘要

本研究旨在检测硝基呋喃类代谢物的残留，合成了呋喃唑酮代谢物3-氨基-2-噁唑烷基酮(AOZ)，对于呋喃唑酮、呋喃西林和呋喃妥因三种药物的代谢物(AOZ、SEM、AHD)合成了免疫原并且制备了相应的多克隆抗体。其中针对呋喃妥因代谢物残留建立并优化了间接酶联免疫方法(ic-ELISA)，针对呋喃西林代谢物研制了一种快速检测的胶体金免疫层析试纸条。 实验首先合成了呋喃唑酮代谢物AOZ，并用仪器鉴定其纯度，完全适合作为标准品使用。然后针对AOZ、SEM和AHD三种代谢物设计了结构合理的半抗原，进行衍生化合成，并用仪器确定了其最终纯度。使用两种方法使半抗原分别与牛血清蛋白、卵清蛋白偶联合成免疫抗原和包被抗原，并对其进行偶联效果的鉴定。 每种免疫原采用2只新西兰大白兔进行免疫，按照既定免疫程序，监测免疫后抗血清效价。进行了4个多月的反复免疫直到获得满意的抗血清效价，采集全部抗血清并进行纯化，最终经过筛选得到每组中较好的抗血清效价分别为153600，307200和614400，完全符合免疫实验要求，并作为之后的免疫分析抗体。 选择呋喃妥因代谢物AHD的抗体建立了相应的间接竞争ELISA方法，并对包被条件、封闭条件、竞争时间等条件进行了优化测定，并且从灵敏度、特异性和准确性三个方面进行了评估。最终优化后ELISA方法的IC50为3.6ng/mL，LOD(90％抑制率对应的浓度)为0.085ng/mL；该抗体不与其结构类似物等有明显交叉反应，特异性良好；通过对猪肉样本添加不同剂量标准品AHD，并对其用苯甲酸进行衍生化处理作为目标检测物，最后检测实际样本回收率和变异系数均达到兽药残留分析要求。 此外，对于呋喃西林代谢物SEM抗体建立了胶体金免疫层析方法并对其进行了优化。首先制备了18nm的胶体金溶液，标记抗体并且纯化。对重悬液、抗原稀释液等反应溶液进行了筛选比较。对优化后试纸条的性能进行了评测，裸眼检测限达到40ng/mL，而且对类似物检测时无交叉反应。实验还对试纸条的可靠性做了确认，设置80个标准样本进行测试，并用ELISA方法作了平行实验，结果两种方法的一致率达到98％。 本实验一方面制备了灵敏度高、特异性良好的硝基呋喃代谢物抗体，可供今后免疫检测分析使用，另一方面建立的AHD间接ELISA方法和SEM胶体金免疫层析方法既满足了对硝基呋喃药物的残留检测，也为今后对硝基呋喃类代谢物免疫检测的进一步研究提供了依据。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章绪论

1.1硝基呋喃类概论

1.1.1硝基呋喃类的理化性质

1.1.2硝基呋喃类的药理性质及应用

1.1.3硝基呋喃类的代谢与分布

1.1.4硝基呋喃类的危害与残留现状

1.2硝基呋喃的仪器检测技术

1.2.1高效液相法(High performance liquid chromatography,HPLC)

1.2.2液相色谱-质谱连用法(Liquid chromatography-Mass Spectrometry,LC-MS)

1.2.3液相色谱串联质谱法(Liquid chromatography-Mass Spectrometry/Mass Spectrometry，LC-MS/MS)

1.3硝基呋喃的免疫分析方法

1.3.1酶联免疫测定法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)

1.3.2.胶体金免疫分析检测技术

1.4本课题研究的内容、目标

第二章硝基呋喃类代谢物完全抗原的合成与鉴定

2.1实验材料

2.1.1药品与试剂

2.1.2仪器与设备

2.1.3溶液系统

2.2实验方法

2.2.1 3-氨基-2-噁唑烷基酮(3-amino-2-oxazolidinone，AOZ)的合成

2.2.2 AOZ的鉴定

2.2.3半抗原的制备

2.2.4半抗原的鉴定

2.2.5完全抗原的制备

2.2.6完全抗原的鉴定(紫外分光光度法)

2.3结果

2.3.1代谢物AOZ的鉴定

2.3.2半抗原的鉴定

2.3.3完全抗原的鉴定

2.4讨论

2.4.1间隔臂的选择

2.4.2载体的选择

2.4.3交联方法的选择

2.4.4最佳交联比

2.5本章小结

第三章硝基呋喃类代谢物抗体的制备与鉴定

3.1试验材料

3.1.1材料和试剂

3.1.2主要溶液

3.1.3仪器设备

3.2实验方法

3.2.1抗血清的制备

3.2.2抗血清的分离与保存

3.2.3抗血清的纯化

3.2.4抗体效价的测定

3.3结果

3.3.1抗血清纯化的结果分析

3.3.2抗体的效价

3.4讨论

3.5本章小结

第四章间接ELISA方法的建立和优化

4.1实验材料

4.1.1药品和试剂

4.1.2主要仪器设备

4.1.3溶液系统

4.2实验方法

4.2.1 AHD的间接ELISA(Competitive indirect ELISA，ic-ELISA)方法的建立

4.2.2 ic-ELISA各参数的优化

4.2.3 ic-ELISA方法评估

4.3结果

4.3.1 ic-ELISA各参数的确定

4.3.2优化后的ic-ELISA

4.3.3 ic-ELISA方法评估

4.4讨论

4.4.1 ELISA方法的影响因素和优化

4.4.2 ic-ELISA的评估

4.5本章小结

第五章胶体金免疫层析试纸条的研制

5.1实验材料

5.1.1试剂

5.1.2主要仪器设备

5.1.3试纸条材料

5.1.4溶液系统

5.2实验方法

5.2.1胶体金的制备

5.2.2胶体金标记抗体蛋白

5.2.3溶液系统的筛选

5.2.4试纸条膜的选择

5.2.5试纸条的组装

5.2.6试纸条的测试方法

5.2.7试纸条质量性能测试

5.3结果

5.3.1抗体浓度测定

5.3.2胶体金的质量鉴定

5.3.3胶体金标记抗体蛋白

5.3.4溶液系统的筛选

5.3.5试纸条的组装与测试

5.3.6试纸条质量性能测试

5.4讨论

5.5本章小结

第六章结论

致谢

参考文献

附录： 作者在攻读硕士学位期间发表的论文