大米蛋白抗氧化肽的制备、分离纯化和结构鉴定

摘要

大米蛋白质具有高生物效价、低过敏性等重要特点，受到了全世界研究者的关注。我国目前还存在着大量不适于直接食用的早稻、碎米、库存陈化米，以及工业消费生成的米渣、米糟，可以提供丰富的大米蛋白资源。抗氧化肽，作为一种天然抗氧化剂，具有强的抗氧化活性和高的安全性，引起了研究者的广泛兴趣。因此，充分开发利用大米蛋白制备抗氧化肽是重要的研究课题，具有一定的社会和经济效益。
　　 本论文以籼米为原料，采用碱溶酸沉法提取得到大米蛋白浓缩物；采用不同的蛋白酶酶解，筛选出水解大米蛋白的最佳酶源为中性蛋白酶；通过响应面法分析优化得到酶解大米蛋白制备抗氧化肽的最佳条件为：[S]5.0％、[E]/[S]2.3％、pH7.0、温度37℃、时间4.2h，该条件下制备的大米蛋白抗氧化肽水解度(DH)为13.26％，对DPPH自由基(DPPH·)的清除率为60.54％。
　　 采用8种不同的体外抗氧化模型进一步测定了大米蛋白酶解产物(NHREPs)的抗氧化活性，探讨了不同的DH对NHREPs抗氧化活性的影响。结果表明，NHREPs的抗氧化活性与其水解度有关，DH为13％的NHREP是良好的电子供体和氢供体，能明显抑制亚油酸体系的自动氧化过程；具有较强的羟基自由基(·OH)及DPPH·清除能力，而清除超氧阴离子(O2-*)能力稍弱；同时具有很强的Fe2+螯合能力。进一步测定不同水解度NHREPs的相对分子质量分布情况，结果发现：水解度为13％时，在500～1,020Da范围的肽段含量达54.73％。
　　 经SP-Sephadex C-25、SephadexG-15和半制备的RP-HPLC分离纯化NHREP(DH=13％)，筛选出抗氧化活性较强的肽组分F3b和F3c。采用MALDI-TOF/TOF MS法测得F3b和F3c的相对分子质量分别为959.5和1002.5。结合TOF-MS/MS和氨基酸分析仪得出：F3b的一级序列为Phe-Arg-Asp-Glu-His-Lys-Lys(简称为FRDEHKK)；F3c的一级序列结构为Lys-His-Asn-Arg-Gly-Asp-Glu-Phe(KHNRGDEF)。
　　 采用固相合成法Fmoc法合成FRDEHKK，进一步验证合成FRDEHKK的抗氧化活性试验发现：FRDEHKK能够抑制亚油酸体系的自动氧化过程，其抑制效果强于α-生育酚；不同剂量的FRDEHKK对自由基的清除能力强弱顺序依次为：·OH＞DPPH·＞O2-(·)。FRDEHKK的还原能力呈现出较强的量效关系；FRDEHKK对Fe2+的螯合能力接近于EDTA。推断本研究中得到的FRDEHKK和KHNRGDEF具有较高的抗氧化活性，是由于其组成氨基酸分子的供氢能力、螯合金属离子能力以及自身结构的稳定性等各方面的综合因素所决定的；多肽通过捕获自由基反应链的过氧化自由基，本身成为较稳定的自由基中间体，阻止或减弱了自由基链式反应的进行。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩写符号说明

声明

第一章绪论

1.1大米蛋白

1.1.1大米蛋白资源概况

1.1.2大米蛋白的营养特点

1.1.3大米蛋白的制备及国内外大米蛋白产品的开发状况

1.2氧化及抗氧化

1.3活性肽

1.4抗氧化活性肽的研究进展

1.4.1天然抗氧化肽

1.4.2植物源抗氧化肽

1.4.3动物源抗氧化肽

1.5本课题的立题背景和意义

1.6本课题的研究内容

参考文献

第二章酶解大米蛋白制备抗氧化肽的工艺研究

2.1引言

2.2材料与仪器

2.2.1材料

2.2.2主要仪器

2.3实验方法

2.3.1大米蛋白的提取

2.3.2大米蛋白的成分分析

2.3.3酶活力的测定

2.3.4大米蛋白抗氧化肽的制备

2.3.5水解度(DH)测定

2.3.6二苯代苦味肼基自由基(DPPH·)清除能力的测定

2.3.7酶解大米蛋白的单因素试验

2.3.8响应面分析法优化酶解工艺试验设计

2.4结果与讨论

2.4.1大米蛋白成分分析

2.4.2酶源的确定

2.4.3不同底物浓度[S]对DH的影响

2.4.4不同酶与底物浓度比[E]／[S]对DH的影响

2.4.5不同pH值对DH的影响

2.4.6不同温度对DH的影响

2.4.7响应面法优化酶解工艺参数

2.5本章小结

参考文献

第三章大米蛋白酶解产物NHREP体外抗氧化活性的研究

3.1前言

3.2材料与仪器

3.2.1材料

3.2.2主要仪器

3.3方法

3.3.1亚油酸体系中抗氧化能力的检测—硫氰酸铁法

3.3.2二苯代苦味肼基自由基(DPPH·)清除能力的测定

3.3.3超氧阴离子自由基(O2-·)清除能力的测定

3.3.4羟基自由基(·OH)清除能力的测定

3.3.5螯合金属离子能力的测定

3.3.6还原能力的测定

3.3.7抑制H2O2诱导的小鼠红细胞溶血实验

3.3.8抑制H2O2诱导的小鼠肝匀浆MDA生成实验

3.3.9 HPLC测定相对分子质量分布

3.3.10统计分析

3.4结果与讨论

3.4.1不同水解度NHREPs对亚油酸体系自动氧化的抑制能力

3.4.2不同水解度NHREPs的DPPH·清除能力

3.4.3不同水解度NHREPs的O2-·及·OH清除能力

3.4.4不同水解度NHREPs的还原能力及金属离子螯合能力

3.4.5不同水解度NHREPs抑制双氧水诱导小鼠红细胞溶血实验

3.4.6不同水解度NHREPs抑制双氧水诱导小鼠肝细胞产生MDA实验

3.4.7水解度为13％的NHREP相对分子质量分布图

3.4.8不同水解度NHREPs体外抗氧化活性的讨论

3.5本章小结

参考文献

第四章大米蛋白抗氧化活性肽的分离纯化

4.1前言

4.2材料与仪器

4.2.1材料

4.2.2主要仪器

4.3实验方法

4.3.1样品制备

4.3.2紫外波长检测

4.3.3离子交换层析分离抗氧化活性肽

4.3.4凝胶色谱Sephadex G-15分离抗氧化活性肽

4.3.5半制备RP-HPLC分离抗氧化活性肽

4.3.6 RP-HPLC分析抗氧化活性肽

4.3.7 DPPH·清除能力的测定

4.3.8抗氧化肽氨基酸组成分析

4.4结果与讨论

4.4.1 NHREP的紫外光谱检测

4.4.2离子交换层析分离NHREP

4.4.3凝胶色谱分离纯化F组分

4.4.4半制备RP-HPLC分离NHREP的凝胶柱洗脱分离组分F3

4.4.5抗氧化活性肽F3b和F3c的纯度

4.4.6抗氧化活性肽F3b和F3c的氨基酸组成分析

4.5本章小结

参考文献

第五章大米蛋白抗氧化活性肽F3b和F3c的结构鉴定

5.1前言

5.2材料与仪器

5.2.1材料

5.2.2主要仪器

5.3实验方法

5.3.1 MALDI-TOF MS质谱测定F3b和F3c质量指纹图谱

5.3.2TOF-MS-MS质谱分析测定F3b和F3c序列

5.4结果与讨论

5.4.1组分F3b和F3c的质量指纹图谱

5.4.2组分F3b和F3c的序列测定

5.4.3抗氧化活性肽的序列比对

5.5本章小结

参考文献

第六章抗氧化活性肽FRDEHKK的固相合成及活性验证

6.1前言

6.2材料与仪器

6.2.1材料

6.2.2主要仪器

6.3实验方法

6.3.1 Fmoc-Tyr(tBu)-OH与Wang树脂的连接

6.3.2 FRDEHKK肽链的延伸

6.3.3肽树脂的切割与产物的分析

6.3.4亚油酸体系中抗氧化能力的检测—硫氰酸铁法

6.3.5 DPPH·清除能力的测定

6.3.6 O2-·清除能力的测定

6.3.7·OH清除能力的测定

6.3.8螯合金属离子能力的测定

6.3.9还原能力的测定

6.4结果与讨论

6.4.1合成FRDEHKK的纯度及质谱鉴定

6.4.2 FRDEHKK对亚油酸体系自动氧化的抑制能力

6.4.3 FRDEHKK的DPPH·清除能力

6.4.4 FRDEHKK的O2-·清除能力

6.4.5 FRDEHKK的·OH清除能力

6.4.6 FRDEHKK的还原能力

6.4.7 FRDEHKK的金属离子螯合能力

6.4.8肽序列与抗氧化活性关系的探讨

6.5本章小结

参考文献

论文主要结论

展望

论文创新点

致谢

攻读博士学位论文期间发表的论文及申请专利