菊粉酶的固态发酵及其保护剂的研究

摘要

菊粉是一种天然的果聚糖，由D-呋喃果糖以β-2,1糖苷键相连，其还原端连接一个葡萄糖基，呈直链结构。我国大量种植的菊芋、菊苣等菊科植物中菊粉含量丰富，具有广阔的应用前景。菊粉酶是一种主要来源于微生物的多糖水解酶，可催化水解菊粉中的β-2，1糖苷键。菊粉酶一般分为外切型和内切型两种，可以分别水解菊粉生产高果糖浆和低聚果糖。微生物生产的菊粉酶一般为同时含有外切型和内切型的混合酶系，混合酶系在水解菊粉生产高果糖浆时比单纯的利用外切型菊粉酶更有效率。
　　 本文首先对实验室保存的一株无花果曲霉产菊粉酶的固态发酵工艺条件进行了优化。采用Placktt-Burman和Box-Behnken实验设计确定了最佳培养基组成和培养条件为：固体基质麸皮10 g，菊芋粉11.47％，NH4H2PO40.76％，NaCl0.5％，MgSO40.05％，ZnSO40.01％，KH2PO40.1％，玉米浆5.71％，吐温-800.5％(均为相对于固体基质的质量分数)，液固比1.3∶1，初始pH5.5，28℃下静止培养72 h，期间翻曲3～4次，酶活最高达到205.14 U/g干曲。
　　 其次对无花果曲霉固态发酵中菊粉酶的提取工艺进行了研究。主要研究了溶剂种类、提取时间、固液比、振荡频率和提取温度等因素对酶活提取的影响，确定了最佳提取工艺：以pH为4.5的0.1mol/L醋酸缓冲液为提取溶剂，提取时间40min，固液比1：20.5，振荡频率207r/min，提取温度39.6℃，菊粉酶的提取得率相对于初始提取条件可以提高50％以上。
　　 再次对从固体基质中提取的粗酶液进行了活性炭过滤、硫酸铵沉淀、透析、PEG浓缩等处理，获得浓缩菊粉酶液。对酶液的酶学性质进行了初步研究，发现该酶的最适反应温度和pH分别为50℃和4.5，在温度50℃以下，pH3.0～8.0范围内，酶具有较好的稳定性。并确定了菊粉酶水解菊粉的最佳反应条件为：菊粉浓度20 g/L，反应体系pH4.5，反应温度50℃，加酶量为25 U/g菊粉。在最适反应条件下，水解7 h，酶解率可以达到89％，水解10 h，酶解率可以达到95％。
　　 最后针对提高菊粉酶稳定性的问题，研究了添加物质对其稳定性的影响。结果表明：CaCl2对菊粉酶的保护效果最好，其次是山梨醇和黄原胶。采用正交实验设计优化出菊粉酶最佳保护剂配方为0.4％的黄原胶、2.5％的山梨醇和150mmol/L的CaCl2。复合保护剂的添加使得菊粉酶的耐热性提高10℃，pH稳定性也有提高。保存实验证明该复合保护剂能明显延长菊粉酶的保存期，在36±1℃下保存第40d时，对照组的酶活保留率为10.3％，而处理组的酶活保留率为48.8％。

目录

文摘

英文文摘

声明

1引言

1.1高果糖浆概述

1.1.1高果糖浆的定义及分类

1.1.2高果糖浆的特性及其应用

1.1.3高果糖浆的生产

1.2微生物菊粉酶研究现状

1.2.1菊粉酶的定义和分类

1.2.2产微生物菊粉酶的菌种选育

1.2.3菊粉酶在高果糖浆生产中的应用

1.3固态发酵

1.3.1固态发酵简介

1.3.2菊粉酶的固态发酵

1.4立题背景和意义

1.5研究内容

2材料与方法

2.1主要材料

2.2实验方法

2.2.1培养基及培养方法

2.2.2菊粉酶提取方法

2.2.3菊粉酶酶活测定方法

2.2.4培养基优化方法

2.2.5固态发酵基质中菊粉酶提取条件研究

2.2.6菊粉酶粗酶液制备及酶学性质研究

2.2.7菊粉酶水解菊粉的最佳条件研究

2.2.8菊粉酶保护剂的研究

3结果与讨论

3.1菊粉酶固态发酵条件研究

3.1.1单因素实验

3.1.2 Plackett-Burman实验

3.1.3 Box-Behnken实验

3.1.4发酵优化后无花果曲霉固态发酵产酶曲线

3.2固态基质中菊粉酶提取条件研究

3.2.1溶剂种类对菊粉酶提取的影响

3.2.2菊粉酶提取实验设计优化结果

3.2.3提取时间对菊粉酶提取的影响

3.3菊粉酶浓缩粗酶液制备及酶学性质研究

3.3.1活性炭脱色

3.3.2(NH4)2SO4分级沉淀

3.3.3透析脱盐

3.3.4菊粉酶粗酶液酶学性质

3.4菊粉酶水解菊粉的最佳条件研究

3.4.1反应体系的pH对菊粉酶水解率的影响

3.4.2反应体系的温度对菊粉酶水解率的影响

3.4.3加酶量对菊粉酶水解率的影响

3.4.4底物浓度对菊粉酶水解率的影响

3.5菊粉酶保护剂研究

3.5.1一些物质对菊粉酶稳定性的影响

3.5.2保护剂浓度对菊粉酶热稳定性的影响

3.5.3复合保护剂配方的优化

3.5.4复合保护剂对菊粉酶热稳定性的影响

3.5.5复合保护剂对菊粉酶pH稳定性的影响

3.5.6酶制剂的保存实验

主要结论

参考文献

致谢

作者在攻读硕士学位期间发表的论文