重组毕赤酵母生产碱性果胶酶的流加策略及工业化放大

摘要

碱性果胶酶(PGL)是指一类在碱性环境中仍然具有较高活性的果胶酶。碱性果胶酶可作为一种天然助剂应用于纺织品,纤维制品等的精炼处理工艺中,对作物表面的纤维质和果胶质等杂质有一定的去除效果,同时对纤维素的损伤效果也不如碱法明显。因此,若将以碱性果胶酶为主的生物酶精练工艺替代传统的高温高碱的化学工艺,不仅可减少环境污染严重和能耗较高等问题,而且可提高棉织物和纺织品的质地。
　　 本课题在前期的研究中已经取得一定的成果:从自然环境中分离筛选得到了一株高产碱性果胶酶的枯草芽胞杆菌Bacillus sp.WSHB04-02。之后利用分子克隆技术,将PGL的基因成功地表达于毕赤酵母GS115中;随后又通过高密度发酵和低温诱导发酵等策略,使PGL的产量有了大幅度的提高。在此基础上,本论文通过详尽分析了在菌体诱导期,利用混合碳源流加对重组Pichia.pastoris GS115高效表达的影响,发现山梨醇与甲醇的混合添加对PGL产量的提高作用较为明显;通过对细胞死亡率,胞内醇氧化酶和蛋白酶降解作用等研究进一步分析了山梨醇在提高PGL的产量时所起的作用。在此基础上,本研究又完成了碱性果胶酶发酵生产的初步放大和中试研究,即从3 L,30 L,1000 L,到5000 L的逐级放大过程。主要研究结果如下:
　　 1为提高重组毕赤酵母生产碱性果胶酶(PGL)的产量和生产强度,在诱导期采用多种碳源与甲醇混合添加的模式。实验结果发现:甘油、山梨醇、乳酸与甲醇的混合添加均可以提高PGL的产量,其中山梨醇与甲醇的混合流加效果最为显著。研究表明,当以一个合适的流速添加山梨醇,甘油和乳酸等碳源时,碱性果胶酶的产量可以明显得到提高。而由于胞内启动子并没有被抑制,即其对应的醇氧化酶的活力没有被削弱,进而使毕赤酵母表达外源蛋白效率提高,且山梨醇对碱性果胶酶产量的提高较为明显。当山梨醇的流速为3.6g(H·L)时,PGL酶活可达1593 U/mL,生产强度为16.7 U/(mL·h),比对照分别提高了84.6％和45.2％,实现了碱性果胶酶的高效生产。
　　 2在之前的研究中发现了山梨醇和甲醇混合添加的方式可以显著提高PGL的产量,当山梨醇的流速为3.6 g/(h·L)时,PGL酶活可达1593 U/mL。为了从机理上研究PGL产量提高的原因,本实验主要考察了以下几个参数指标的变化:首先山梨醇的添加显著降低了细胞死亡率,在诱导90 h以后,细胞死亡率从25％降低为9％左右;其次,3.6 g/(h·L)的山梨醇流速不但不会抑制启动子的表达,甚至有一定的促进作用,胞内醇氧化酶AOX的酶活为6.9 U/g(对照为5.7 U/g);第三,由于细胞死亡率的降低,一定程度上削弱了由于细胞死亡而向胞外释放蛋白酶的过程,进而降低了蛋白酶对PGL的分解作用。所以我们认为在毕赤酵母表达体系中,山梨醇和甲醇的混合流加对于提高外源蛋白的产量有着明显的促进作用。
　　 3为实现碱性果胶酶的工业化生产,进行了不同反应器规模的放大研究,完成了从3L、30 L、1000 L至5000 L发酵罐的逐级放大。在克服了溶氧,传质等限制性问题以后,产量得到了一定的提高,且发酵过程的可重复性得到了明显的改善。30 L发酵罐的产量最大可达1425 U/ml,而5000 L发酵罐的产量最大也可达到503 U/ml。由于在中试规模的发酵过程中无法控制较低的诱导温度,使产量无法进一步提升,所以如何提高反应器的传热能力,降低发酵过程产生的高热量以确保较低的诱导温度是我们以后研究工作的一个方向。

目录

文摘

英文文摘

第一章 绪论

1.1 背景

1.2 果胶酶的分类

1.2.1 果胶质

1.2.2 果胶酶

1.3 毕赤酵母表达体系

1.3.1 毕赤酵母表达系统简介

1.3.2 毕赤酵母表达系统的优缺点

1.3.3 重组毕赤酵母的发酵工艺流程

1.4 立题意义

1.4.1 碱性果胶酶在棉织物前处理中的应用

1.4.2 碱性果胶酶的研究现状

1.5 本论文主要研究内容

第二章 材料与方法

2.1 菌体

2.2 仪器

2.3 培养基

2.3.1 YPD种子培养基

2.3.2 分批发酵培养基(Barch Medium)

2.3.3 补料生长培养基(Fed-batch Medium)

2.3.4 发酵诱导培养基(Inducing Medium)

2.4 培养方法

2.5 测定方法

第三章 结果与讨论

3.1 双碳源添加的摇瓶研究

3.2 双碳源混合流加控制策略

3.2.1 山梨醇与甲醇的混合流加

3.2.2 甘油与甲醇的混合流加

3.2.3 乳酸与甲醇的混合流加

3.2.4 不同碳源流加对胞内AOX酶的影响

3.3 山梨醇的添加对PGL产量提高的机理研究

3.3.1 山梨醇与甲醇混合流加对P.pastoris生长和表达的影响

3.3.2 山梨醇的添加对胞内AOX酶活的影响

3.3.3 添加山梨醇对细胞活性的影响

3.3.4 添加山梨醇对蛋白酶的影响

3.4 碱性果胶酶的发酵过程放大研究

3.5 结论

第四章 展望

致谢

参考文献

附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文