一种用温度策略促进重组毕赤酵母高产碱性果胶酶的方法

摘要

一种用温度策略促进重组毕赤酵母高产碱性果胶酶的方法，属于温度控制策略在发酵过程优化中的应用技术领域。本发明采用分泌性表达载体pPIC9K重组毕赤酵母Pichia pastoris(pel)为发酵菌株，生长阶段控制温度为30℃，指数流加生长培养基，促进菌体高密度生长，当菌体量达到140g/L后，将温度降至22℃，维持发酵过程中菌体量恒定，流加甲醇至20g/L，诱导碱性果胶酶表达。通过在发酵过程中降低诱导阶段温度，最终实现了提高碱性果胶酶产量的目标。本发明的优点是能有效地提高碱性果胶酶的产量及生产强度，并减少发酵液中杂蛋白的含量，提高了下游提取时的效率，增加了产品纯度，并且减少了能耗，有利于工业化大规模生产。

说明书

技术领域

一种用温度策略促进重组毕赤酵母高产碱性果胶酶的方法，涉及温度控制策略在发酵过程优化中的应用技术领域。

背景技术

碱性果胶酶(Polygalacturonate lyase，简称PGL)是一种主要的新型纺织品清洁生产专用酶制剂，作为棉织物生物精练过程中至关重要的酶制剂，其研制及在棉针织物精练中的应用，使一种全新温和的绿色精练方式成为可能。碱性果胶酶的生物精练专一性，能有效分解去除在棉纤维表面对棉蜡等疏水性共生物起黏结作用的果胶质，使疏水性物质从棉纤维表面脱落，从而达到精练效果，而纤维本身不受到损伤。因此，经生物精练的棉纤维能最大程度的保持纤维强度，失重小，织物手感柔软厚实，且富有弹性，并且克服了传统碱精练过程中棉纤维损失较大，强度损伤严重及环境污染严重等缺点。

目前，国内对碱性果胶酶的研究工作主要停留在对野生菌种的筛选及酶学性质的研究阶段，而对碱性果胶酶基因工程菌的构建及发酵过程优化仍处于起步阶段。毕赤酵母(Pichia pastoris)是近年来发展迅速的真核表达系统，以其外源基因稳定、目的蛋白表达量高、分泌效率高等特性而备受关注。迄今为止，已有400多种外源蛋白在该体系中成功表达。在前期研究中，本研究室在分离筛选得到一株碱性果胶酶高产菌株WSHB04-02的基础上，扩增出编码碱性果胶酶的基因，并成功表达于Pichia pastoris(pel)中，菌种保藏号为CGMCC No.2143。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用低温策略促进重组毕赤酵母发酵高产碱性果胶酶的方法，本发明工艺简单易行，大幅度提高了碱性果胶酶的产量及生产强度，并减少了发酵液中杂蛋白的含量，提高了下游提取时的效率，增加了产品纯度，并且低温减少能耗，有利于大规模工业化生产。同时对于指导其它以毕赤酵母表达体系分泌表达的外源蛋白的表达量的提高具有重要意义。

本发明技术方案：一种用温度策略促进重组毕赤酵母高产碱性果胶酶的方法：

(1)高密度生长阶段：控制重组毕赤酵母Pichia pastoris(pel)生长阶段的温度为30℃，pH5.5；当发酵罐中甘油耗尽时，DO陡然上升，以指数流加法流加含12mL/L PTM1的50％甘油，流速采用先上升后下降的方式，以通气量和搅拌转速控制DO在30％，直到菌体干重达到140g/L；

(2)高效表达阶段：

当补料生长阶段结束后，将发酵温度降到22℃，同时流加含12mL/L PTM1的100％的甲醇，控制发酵液中甲醇浓度达到20g/L，如此诱导表达100h后结束发酵；

所述PTM1液的组成为：CuSO₄·5H₂O 6.0g/L，NaI 0.08g/L，MnSO₄·H₂O 3.0g/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.2g/L，H₃BO₃ 0.2g/L，CoCl₂ 0.5g/L，ZnCl₂ 20.0g/L，FeSO₄·7H₂O 65.0g/L，生物素0.2g/L，浓硫酸5.0mL/L，以去离子水定容。

菌种：毕赤酵母(Pichia pastoris pel)，具有His⁺和Mut⁺表型，拷贝数为2～3个，菌种保藏号为CGMCC No.2143。

培养基

YEPD活化培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母膏10g/L。

BMGY种子培养基：YNB(无氨基酵母氮基)13.4g/L，甘油10g/L，生物素0.4mg/L，0.1mol/L pH6.0磷酸钾缓冲溶液25mL/L。

分批发酵培养基(BSM)：85％磷酸26.7mL/L，CaSO₄ 0.93g/L，K₂SO₄ 18.2g/L，MgSO₄·7H₂O 14.9g/L，KOH 4.13g/L，甘油40.0g/L，PTMl 4.35mL/L，28％氨水调pH5.5。

PTM1液：CuSO₄·5H₂O 6.0g/L，NaI 0.08g/L，MnSO₄·H₂O 3.0g/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.2g/L，H₃BO₃ 0.2g/L，CoCl₂ 0.5g/L，ZnCl₂ 20.0g/L，FeSO₄·7H₂O65.0g/L，生物素0.2g/L，浓硫酸5.0mL/L，以去离子水定容。

补料生长培养基：50％(W/V)甘油(含12mL/L PTM1)。

发酵诱导培养基：100％甲醇(含12mL/L PTM1)。

培养方法

从甘油管中接400μL菌液于25mLYEPD中，过夜14h培养后按1％的接种量转移到BMGY中(500mL三角瓶装50mL)，于30℃、200r/min培养24h。将BMGY中菌液按10％接种量接入3L全自动发酵罐，以25％氨水控制pH5.5，温度30℃，调节搅拌转速和通气量维持溶氧30％以上。当甘油耗尽(DO迅速上升)时，开始流加补料生长培养基。当菌体达到一定浓度后，停止补料。待甘油再次耗尽，继续保持基质匮乏状态约1h后，开始流加诱导培养基，诱导碱性果胶酶表达。

碱性果胶酶测定方法

反应体系中包括粗酶稀释液20μL，含0.2％聚半乳糖醛酸的甘氨酸-NaOH(0.2mol/L)缓冲液(pH9.4，含有0.44mmol/L的CaCl2₎2mL，以无活性的酶液作为空白对照，以含底物的缓冲溶液的加入起动酶促反应；反应条件为45℃反应15min，用3ml 0.03mol/L的磷酸终止反应，在235nm处测定其吸光度值。一个标准酶活单位(1U)定义为：每分钟使聚半乳糖醛酸裂解产生1μmol的不饱和聚半乳糖醛酸的酶量。

提高碱性果胶酶产量的培养方式

分阶段控制发酵液的温度，提高碱性果胶酶的产量。菌体生长阶段将温度控制在30℃，当培养基中甘油耗尽后，采用甘油的指数流加法使菌体高密度生长，当菌体干重达到140g/L时，停止甘油流加，当DO反弹后，进入甲醇诱导表达阶段。此时，将反应器中温度调至22℃，控制体系中甲醇浓度在20g/L，直到发酵结束。

本发明的有益效果：利用本发明能大幅提高碱性果胶酶的产量及生产强度，产量由376U/mL提高到750U/mL，生产强度由4.06U/mL/h提高到7.60U/mL/h，并且降低了发酵液中杂蛋白的含量。本发明的低温策略3L罐上发酵达到先进水平，并且对重组毕赤酵母生产其它外源蛋白具有一定的指导意义。

生物材料样品保藏

重组毕赤酵母Pichia pastoris(pel)菌株，已于2007年8月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.2143。

具体实施方式

对照实施例：本发明所采用的重组毕赤酵母Pichia pastoris(pel)，在生长阶段指数流加甘油使菌体干重达140g/L后，进入甲醇诱导阶段，控制诱导温度为30℃，体系中甲醇浓度20g/L，直到发酵结束。碱性果胶酶的产量为376U/mL，生产强度为4.06U/mL/h。

实施例1：甲醇诱导采用低温诱导策略，其余条件同对照实施例。进入诱导阶段后，将温度降低并维持在26℃，直到发酵结束。结果：碱性果胶酶产量为556.5U/mL，生产强度为5.09U/mL/h。

实施例2：甲醇诱导采用低温诱导策略，其余条件同对照实施例。进入诱导阶段后，将温度降低并维持在22℃，直到发酵结束。结果：碱性果胶酶产量为750U/mL，生产强度为7.60U/mL/h。